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新鮮冰凍**章解凍的FFP誘導內皮細胞NO分泌機制及功能研究 失血性休克(Hemorrhagic shock, HS)是軍民和居民戰(zhàn)(創(chuàng))傷死亡的主要原因。在臨床治療過程中,與傳統(tǒng)復蘇液乳酸林格氏液(lactated ringer, LR)相比,新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma, FFP)因其在復蘇病員中提高患者生存率,具有一定的優(yōu)勢,被臨床創(chuàng)傷救治廣泛采用。而一氧化氮(nitric oxide, NO)是介導內皮細胞功能重要分子,我們設想FFP復蘇失血性休克的療效可能得益于誘導NO分泌和舒張血管。為了探討FFP復蘇作用分子機制,本文采用NO/Nitrite/Nitrate分析法首先檢測了HS大鼠模型FFP及LR復蘇后不同時間點血清中NO含量,結果發(fā)現(xiàn)FFP復蘇后HS大鼠血清中NO含量顯著增加(p0.05)。與單獨HS組大鼠相比,FFP復蘇組HS大鼠血清中NO含量增加幅度大,出現(xiàn)時間早(p0.05),而LR復蘇卻降低大鼠HS復蘇后各時間檢測點NO含量。同樣對體外培養(yǎng)人肺正常微血管內皮細胞(HPMECs)和人淋巴管內皮細胞(HDLECs)FFP處理后NO含量進行分析,結果FFP處理后血管內皮細胞NO生成同樣增加,與對照組相比統(tǒng)計學有顯著性差異(p0.05)。為了探討FFP復蘇對HS大鼠血管舒張功能的影響,隨后測定各組大鼠乙酰*誘導內皮依賴性血管舒張反應,與單獨HS組相比,結果發(fā)現(xiàn)FFP復蘇顯著增加乙酰*誘發(fā)內皮依賴性血管舒張反應(分別是49±4mmHg與37±4 mmHg)(p0.05)。進一步探討FFP誘導內皮細胞NO分泌分子機制,采用磷酸化蛋白激酶抗體芯片和免疫印跡方法篩選和鑒定FFP處理后內皮細胞相關蛋白激酶磷酸化,結果發(fā)現(xiàn)為FFP顯著增加兩株內皮細胞12種蛋白激酶磷酸化,且在兩株內皮細胞中FFP均能誘導AMPKα1,Akt1和eNOS磷酸化。FFP誘導eNOS磷酸化在FFP復蘇HS大鼠的肺組織中同樣得到了證實。表明FFP體內外均能激活AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉導通路。分別采用Compound C(AMPK的抑制劑),LY294002(PI3K／Akt抑制劑)或L-NAME(NOS抑制劑)預處理HPMECs細胞,阻擋AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉導通路,結果為上述三種抑制劑均能抑制FFP誘導eNOS激活和NO生成,提示AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉導通路激活介導FFP誘導NO分泌和血管舒張。 本項目報道FFP誘導增加HS大鼠血清和體外培養(yǎng)內皮細胞上清NO含量,并進一步篩選和鑒定出AMPKα1／Akt1／eNOS信號轉導通路介導FFP誘導NO分泌和血管舒張,揭示了FFP復蘇保護血管內皮細胞新機制。為了進一步探討FFP誘導血管內皮細胞增加NO抑制HS誘導血管收縮改善微循環(huán)及修復內皮細胞功能提供科學依據(jù)。 第二章解凍的FFP對血管內皮細胞遷移的影響及機制研究 失血性休克是創(chuàng)傷后死亡的首要原因。zui近的臨床研究表明,盡早、盡快地采用新鮮冰凍血漿(fresh frozen plasma, FFP)進行復蘇能顯著改善臨床失血性休克復蘇效果。為了滿足各地救治中心對FFP日益增長的需求及快速便捷獲得FFP,經批準新鮮解凍血漿4℃貯存不多于5天仍可用臨床復蘇。研究報道FFP中含有高濃度與內皮細胞遷移有關的轉化生長因子-β(transform growth factor-β, TGF-β)。由此我們設想FFP可能促進內皮細胞遷移,貯存的FFP可能改變了生長因子水平和信號轉導,從而降低FFP療效。本項目以遷移力作為功能研究著眼點,比較新鮮解凍血漿(FFP Day 0)和4℃貯存5天FFP(FFP Day 5)在正常氧供和缺氧條件下誘導內皮細胞遷移能力及其對內皮細胞TGF-p信號轉導通路影響以及FFP貯存過程中TGF-p濃度變化。FFP(Day 0)和FFP(Day 5)分別處理人肺微血管內皮細胞(Human pulmonary microvascular endothelial cells, HPMECs)和人淋巴管內皮細胞(human dermal lymphatic endothelial cells, HDLECs)后,行遷移實驗和Western印跡分析,結果發(fā)現(xiàn)：1)在正常供氧和缺氧條件下,FFP(Day 0)和FFP(Day 5)均能促進細胞遷移,而FFP(Day 5)促進細胞遷移能力顯著下降(p0.05)；2)FFP(Day 0)與FFP(Day 5)相比,TGF-β1水平顯著升高(p0.05)；3)抑制TGF-βI型受體ALK5的活性后,增強FFP(Day 0)和FFP(Day 5)誘導內皮細胞遷移能力；4)FFP處理后顯著增加TGF-p信號轉導通路關鍵分子Smad2／3磷酸化,預處理ALK5活性可抑制其磷酸化。在體外培養(yǎng)兩株內皮細胞中,FFP(Day 5)誘導增加Smad2／3磷酸化幅度大,與FFP(Day 0)相比,具有顯著性差異(p0.05)。結果表明TGF-β1／ALK5／Smad2／3信號轉導通路參與抑制FFP誘導內皮細胞遷移,標準貯存導致TGF-β1水平升高和增加TGF-β1／ALK5／Smad2／3信號通路轉導進而削弱FFP促進內皮細胞遷移。 本項目報道FFP不管是在正常供氧還是在缺氧條件下均能誘導內皮細胞遷移,貯存將增加細胞因子TGF-β1水平及增強TGF-β1/ALK5/Smad2/3信號通路轉導,并降低FFP誘導內皮細胞遷移,為進一步探討FFP通過誘導內皮細胞遷移參與失血性休克后血管內皮完整和功能的恢復提供科學依據(jù)。