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應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)估算有效光反應(yīng)中心含量
應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)估算有效光反應(yīng)中心含量
PSII可與PSI協(xié)同從水中獲取電子生成還原體、驅(qū)動(dòng)光化學(xué)反應(yīng)和植物營(yíng)養(yǎng)循環(huán)。因此有效PSII光反應(yīng)中心([PSII]active)的含量可作為植物生產(chǎn)力評(píng)估的基礎(chǔ)因子，同時(shí)也是評(píng)估植物光合速率、研究植物脅迫響應(yīng)的關(guān)鍵。而對(duì)于液體樣品，[PSII]active含量同樣是評(píng)估水生生物光合作用速率以及分析浮游植物對(duì)脅迫的響應(yīng)的關(guān)鍵參數(shù)。但傳統(tǒng)上缺少穩(wěn)定、可靠、快速的 [PSII]active含量的測(cè)量方法。
本文將介紹加拿大蒙特愛立森大學(xué)的Campbell教授的研究------應(yīng)用FRR葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行[PSII]active含量估算的方法。該方法有效解決了傳統(tǒng)測(cè)量方法存在的問題。其原理是：在一定體積下：
a)F’o強(qiáng)度與[PSII]active色素含量相關(guān)；
b)σ’PSII與PSII色素總含量相關(guān)。
因此，F(xiàn)’o/σ’PSII可以代表單位體積的[PSII]active含量。(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)。而這兩個(gè)參數(shù)都可以利用快速飽和及弛豫熒光誘導(dǎo)程序(fast repletion and relaxation (FRR) ?uorescence induction)獲得。(注：σ’PSII: 光適應(yīng)狀態(tài)下PSII的有效吸收截面；F’o：光適應(yīng)下的基礎(chǔ)熒光。)
為了證明該方法用于估算[PSII]active含量可靠、可行，即受非光化熒光淬滅影響很小、測(cè)量快速并且穩(wěn)定、具有時(shí)間分辨性、可應(yīng)用于對(duì)湖泊和海洋水體的初級(jí)生產(chǎn)力的快速評(píng)估，該研究進(jìn)行了209次成對(duì)測(cè)定，對(duì)不同培養(yǎng)和處理?xiàng)l件下的海洋藍(lán)藻、分別在高光和低光處理下的原生態(tài)型球藻、北極和溫帶的綠藻、兩種中心硅藻進(jìn)行測(cè)試。
由于藻類的生理狀態(tài)對(duì)培養(yǎng)密度、光照條件、氣體狀態(tài)、溫度、pH值等都很敏感，進(jìn)而直接影響所得參數(shù)和公式的科學(xué)性，所以需要精確控制培養(yǎng)條件并實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)培養(yǎng)狀態(tài)。因此本研究使用FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器對(duì)中心硅藻兩個(gè)藻株分別在2種不同狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)和監(jiān)測(cè)，精確控制營(yíng)養(yǎng)濃度、溫度、光照，并自動(dòng)進(jìn)行恒化培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中儀器自動(dòng)使用水蒸氣飽和的空氣氣泡混勻，避免沉降。(FMT150光養(yǎng)生物反應(yīng)器介紹見后附)
之后使用FL3500(當(dāng)前升級(jí)為FL6000)測(cè)量每個(gè)樣品的F’o和σ’PSII，用以計(jì)算[PSII]active。FL3500可自動(dòng)控制和測(cè)量樣品溫度、預(yù)施光照、光化光、單周轉(zhuǎn)飽和光閃、QA再氧化等8種默認(rèn)測(cè)量程序、精確自定義程序等。
同時(shí)使用熒光光纖氧氣傳感器測(cè)量密閉比色皿里樣品的溶氧濃度。氧氣的測(cè)量可由儀器自帶軟件程序自動(dòng)控制。
放氧測(cè)量過(guò)程如下圖所示：在FRR測(cè)量過(guò)程中，氧氣濃度隨激發(fā)光變化并與時(shí)間(橫軸)相對(duì)應(yīng)。將氧探頭固定在FL3500自動(dòng)控溫探頭上，一同插入FL3500測(cè)量單元內(nèi)的待測(cè)樣品中。FL3500具有磁力攪拌功能，該功能可由觸控面板控制，也可由FL3500自帶軟件FluorWin程序精確定義。
在初始300s的暗適應(yīng)過(guò)程中記錄氧氣濃度作為暗呼吸值；之后用低光(20 µmol.m-2.s-1)進(jìn)行預(yù)光照激活光系統(tǒng)并測(cè)量氧氣；在一個(gè)FRR程序結(jié)束后立刻測(cè)量氧氣濃度作為在FRR過(guò)程中的呼吸。二者差值用于估算樣品中[PSII]active含量。
之后將樣品置于光下300 s；再次進(jìn)行FRR誘導(dǎo)(見下圖)并測(cè)量氧濃度。再次估算樣品中[PSII]active含量。公式為：
μmol PSII L-1=μmol O2s-1L-1×(25.025×10-3s Flash-1)×(4 Flash 1×1 PSII/O2)
FRR測(cè)量過(guò)程如下圖所示：*行300 μs的暗適應(yīng)。預(yù)光照之后使用40個(gè)(間隔2 μs)單周轉(zhuǎn)光閃(1.2 μs， µmol.m-2.s-1)的激發(fā)序列進(jìn)行FRR誘導(dǎo)，以逐漸關(guān)閉全部PSII；在這個(gè)過(guò)程中得到Fo、FM、σPSII、ρ(表示PSII 光反應(yīng)中心的連通性)。之后降低光閃重復(fù)速率，PSII逐漸打開，此過(guò)程持續(xù)0.25 s。黑暗2 s，PSII打開。再施加第二次FRR誘導(dǎo)，得到F’o2、F’M2s、σ’PSII2s……
使用放氧法得到的[PSII]active對(duì)FRR得到的 [PSII]active=F’o/σ’PSII 公式進(jìn)行校正，得到校正參數(shù)。
本研究驗(yàn)證了前人(Oxborough et al. 2012; Silsbe et al. 2015)的假設(shè)，應(yīng)用FRR測(cè)量得到的[PSII]active矯正公式適用于本文所述所有藻類樣品，包括：呈指數(shù)增長(zhǎng)的樣品、短期生理波動(dòng)的非穩(wěn)態(tài)樣品、光抑制樣品、低濃度樣品、光適應(yīng)下的樣品，并且受非光化熒光淬滅影響很小。
因此可以用FRR測(cè)量程序來(lái)估算湖泊和海洋不斷變化的環(huán)境中的初級(jí)生產(chǎn)力。
本案例文獻(xiàn)： Murphy C. D., Ni G., Li G., et al. (2016) Quantitating active photosystem II reaction center content from fluorescence induction transients. Limnol. Oceanogr. Methods. DOI:10.1002/lom3.
北京易科泰生態(tài)技術(shù)有限公司是由科學(xué)家創(chuàng)建并為科學(xué)家提供科技服務(wù)的*企業(yè)，是PSI公司在中國(guó)的代理和技術(shù)咨詢服務(wù)中心。易科泰生態(tài)技術(shù)公司在青島、西安設(shè)有分公司，在全國(guó)各地設(shè)有辦事處，北京總部設(shè)立有 EcoLab 實(shí)驗(yàn)室以提供實(shí)驗(yàn)研究合作、儀器技術(shù)培訓(xùn)等。
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