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【中國(guó)儀器網(wǎng) 行業(yè)應(yīng)用】PCR 技術(shù)，即聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是由美國(guó) PE Cetus 公司的 Kary Mullis 在 1983 年(1993 年獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng))建立的。其原理類似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。即通過(guò)模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件，在體外特異性擴(kuò)增DNA片段的一種技術(shù)。
熒光定量PCR(qPCR)是PCR較為傳統(tǒng)的PCR技術(shù)，經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，已是很成熟的實(shí)驗(yàn)方案了。其中，常用的是Taqman法和SYBR Green法。而在這二種方法當(dāng)中，Taqman法又以其特異性高、定量，得到廣大用戶的認(rèn)可。
但事實(shí)上Taqman法熒光PCR還是一個(gè)相對(duì)定量的辦法。它測(cè)的是一個(gè)Ct值，也就是PCR到第幾個(gè)循環(huán)，熒光強(qiáng)度達(dá)到了一個(gè)設(shè)定值。要想用Taqman方法得到：樣本中到底有幾個(gè)目標(biāo)基因的拷貝，那么還是要再做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品的(qPCR)曲線。才能知道樣本的Ct值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的哪個(gè)位置上。再進(jìn)一步推算出樣本中的拷貝數(shù)量。
這樣做，它首先要做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線，這樣的話，一來(lái)增加了工作量，另一方面，因?yàn)橐肓藰?biāo)準(zhǔn)品，也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的誤差，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)中又多引入了一個(gè)實(shí)驗(yàn)的誤差變量。
科學(xué)家為了克服傳統(tǒng)定量PCR的上述兩個(gè)弱點(diǎn)，那么又新發(fā)明了微滴數(shù)字PCR。 數(shù)字PCR(Digital PCR-dPCR)技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR(qPCR)技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。 由于這種檢測(cè)方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、性，dPCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫(kù)定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景，已經(jīng)受到越來(lái)越多的關(guān)注。 數(shù)字PCR在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域哪些研究方向發(fā)揮重要作用呢？小編盤點(diǎn)了以下11個(gè)研究方向。
1. 基因表達(dá)差異研究
檢測(cè)時(shí)*不依賴傳統(tǒng)的Ct值即可實(shí)現(xiàn)真正意義上的定量，從而提供了比實(shí)時(shí)熒光定量PCR更的基因差異表達(dá)研究，尤其對(duì)于那些靶基因表達(dá)差異微小的情況：microRNA、lncRNAs等的表達(dá)分析、等位基因的不平衡表達(dá)、單細(xì)胞基因表達(dá)分析、Exosome內(nèi)核酸分子定量分析等。
2. 拷貝數(shù)變異(CNV)研究
微滴化的樣品處理及檢測(cè)，這種擺脫Ct值的計(jì)算方法而直接獲取目標(biāo)基因的拷貝數(shù)，為拷貝數(shù)變異的研究提供了的檢測(cè)精度。是其他諸如二代測(cè)序、芯片雜交等平臺(tái)無(wú)法達(dá)到的，因此采用數(shù)字PCR能夠有效對(duì)NGS、aCGH的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，并具有成本低、通量高的特點(diǎn)。
3. 低豐度及稀有序列的定量
目前對(duì)于低豐度目標(biāo)序列的檢測(cè)，定量PCR、雜交、毛細(xì)管測(cè)序及NGS等方法都因受到背景DNA的干擾，使得檢測(cè)靈敏度及性都達(dá)不到精細(xì)定量的要求(如定量PCR檢測(cè)中Ct值大于33的情況下，其重復(fù)性就不是很高)， 而微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)通過(guò)核心的微滴化處理，使得稀有的核酸序列從大量的背景DNA中分離出來(lái)，從而提高了檢測(cè)的靈敏度及重復(fù)性。
此外，由于樣品微滴化處理的同時(shí)，也將樣品中可能存在的抑制劑進(jìn)行了分裝，提高了數(shù)字PCR擴(kuò)增對(duì)于抑制劑的耐受程度，因此可具體應(yīng)用于很多臨床樣品(血液、尿液、糞便、痰液、腦脊液等)中對(duì)腫瘤核酸標(biāo)記物的檢測(cè)。一般而言，毛細(xì)管電泳和定量PCR的檢測(cè)靈敏度約在10%;NGS的靈敏度可達(dá)到1%;而ddPCR的檢測(cè)下限為0.001%。
4. 甲基化含量鑒定
作為表觀遺傳學(xué)研究中重要的一個(gè)研究方向——甲基化程度分析，現(xiàn)階段有不同的方法或技術(shù)來(lái)進(jìn)行研究：如傳統(tǒng)的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測(cè)序統(tǒng)計(jì)法、抗體檢測(cè)法、定量PCR檢測(cè)法等。這些方法皆因方法學(xué)的問題而不能獲得的定量，而微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)通過(guò)對(duì)樣品的微滴化處理及目標(biāo)因子的拷貝數(shù)定量，為甲基化程度的定量檢測(cè)提供了一種全新的技術(shù)。
5. *的伴隨診斷
常用體液來(lái)源(如血液，胸腹水，唾液及尿液等)的待檢標(biāo)本中的DNA，有正常脫落體細(xì)胞和病變脫落細(xì)胞兩種來(lái)源，前者的量遠(yuǎn)大于后者。通過(guò)微液滴處理能在每個(gè)微液滴中有效減少正常體細(xì)胞DNA的干擾，實(shí)現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物的有效檢測(cè)，如EGFR，ALK，ROS1，KRAS、BRAF等基因的突變檢測(cè)、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)等，應(yīng)用于腫瘤醫(yī)學(xué)的伴隨診斷。
6. 無(wú)創(chuàng)*
無(wú)創(chuàng)傷的產(chǎn)前診斷, 如21號(hào)染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地貧檢測(cè)或已知父母基因型的其它核酸病檢測(cè)(孟德爾相關(guān)遺傳疾病)。目前標(biāo)本來(lái)源主要為血液，而待檢測(cè)的胎兒DNA受到母體DNA的干擾，影響了檢測(cè)的準(zhǔn)確性。而QX200檢測(cè)系統(tǒng)*的微滴化技術(shù)*可以作為二代測(cè)序法的補(bǔ)充來(lái)進(jìn)行的無(wú)創(chuàng)傷產(chǎn)前診斷，從而提高工作效率及節(jié)約成本。
7. 病原微生物的檢測(cè)(病毒、細(xì)菌等)
疾病預(yù)防控制中心、出入境檢驗(yàn)檢疫局系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室目前主要采用基于TaqMan探針法的定量PCR體系對(duì)病原微生物進(jìn)行核酸水平的檢測(cè)，而這些目前正在使用著的檢測(cè)體系可以無(wú)縫地轉(zhuǎn)移到QX200上，從而滿足該類實(shí)驗(yàn)室對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的要求：靈敏度更高、重復(fù)性更好、無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量結(jié)果，同時(shí)操作簡(jiǎn)便。
對(duì)于其他類型的研究實(shí)驗(yàn)室，也可以利用ddPCR靈敏度高的特點(diǎn)，對(duì)各種樣品中的病原微生物展開廣泛的研究。如HIV抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過(guò)程中病毒殘留量的監(jiān)控;HBV耐藥突變的檢測(cè);HCV的分子分型;抗**的院內(nèi)感染監(jiān)控;環(huán)境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等等。
8. 轉(zhuǎn)基因食品或成分的檢測(cè)
目前在確定轉(zhuǎn)基因作物或成分的含量時(shí)采取定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線法，這種方法需要依賴于已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品(Certified Reference Materials Calibrants, CRMCs)。ddPCR定量的方式可以*解決這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定標(biāo)工作。
9. 二代測(cè)序輔助建庫(kù)
目前靶向測(cè)序建庫(kù)方法包括擴(kuò)增子方法，在均相溶液中，當(dāng)擴(kuò)增引物增加時(shí)，由于擴(kuò)增引物之間的相互作用，從而影響擴(kuò)增的效率;如果將其分散到大量微液滴中擴(kuò)增，將可大大降低引物間相互作用，提高擴(kuò)增效率。同時(shí)還可以實(shí)現(xiàn)對(duì)于少量模板的有效擴(kuò)增，得到更多的有效測(cè)序數(shù)據(jù)。
10. CRISPR-Cas9基因編輯結(jié)果驗(yàn)證
CRISPR-Cas9技術(shù)的發(fā)明，是基因編輯技術(shù)的一大突破，但如何驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)是否成功，仍需要高靈敏度的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR技術(shù)可以滿足這一需求。Broad研究所張鋒團(tuán)隊(duì)發(fā)明了以CRISPR為基礎(chǔ)的SHERLOCK技術(shù)可以對(duì)核酸進(jìn)行高靈敏度的定性檢測(cè)，但定量評(píng)估時(shí)仍采取了數(shù)字PCR進(jìn)行確認(rèn)。
11. *的實(shí)時(shí)監(jiān)控
已有數(shù)篇文章報(bào)道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對(duì)患者治療過(guò)程中的循環(huán)腫瘤DNA(ctDNA)進(jìn)行檢測(cè)，實(shí)時(shí)監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和腸癌等多種腫瘤患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比，ctDNA突變及豐度改變通常會(huì)提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時(shí)調(diào)整治療方案，使患者得到更有效的治療。
隨著數(shù)字PCR熒光通道的增加和多指標(biāo)檢測(cè)的成熟，數(shù)字PCR將會(huì)進(jìn)入更多應(yīng)用領(lǐng)域，有力推動(dòng)生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、檢驗(yàn)檢疫、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的快速發(fā)展。
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