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人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎)的組織，將其剪碎至1mm3的組織塊，再采用如下方法進(jìn)行原代細(xì)胞
分離培養(yǎng)：
一、懸浮細(xì)胞的分離方法
1、將血液、羊水、胸水或腹水等懸液直接轉(zhuǎn)至離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。
2、去掉上清，離心沉淀用無(wú)鈣、鎂的PBS清洗后1000rpm/分鐘離心5分鐘。此步重復(fù)兩次。
3、用培養(yǎng)基重懸，調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度后分瓶培養(yǎng)。
4、如選用懸液中某種細(xì)胞，可采用離心后的細(xì)胞分層液收獲目的細(xì)胞。
二、實(shí)體組織材料的分離方法
(一)機(jī)械分散法
1、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織，用剪刀剪碎至1mm3的組織塊。
2、用PBS清洗兩次后
?、儆梦艽荡?，分散組織細(xì)胞。
?、诨?qū)⒁殉浞旨羲榉稚⒌慕M織放在注射器內(nèi)(用九號(hào)針)，使細(xì)胞通過針頭壓出。
?、刍蛟诓讳P鋼紗網(wǎng)內(nèi)用鈍物(注射器鈍端)壓擠使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。
3、收集細(xì)胞轉(zhuǎn)入離心管中，1000rpm/分鐘離心5分鐘。
4、去上清，加入含血清的培養(yǎng)基，重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
(二)消化分離法
1、酶消化分離法(過夜冷消化法)
①細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，如肝、腎、甲狀腺、羊膜、胚胎組織、上皮組織等，用Hanks液清洗組織三次，剪成碎塊大小為4毫米左右。
?、谠儆肏anks液洗2-3次以除去血球和脂肪組織。
?、奂尤?.25%的*，搖勻后放4℃過夜。
?、艽稳赵儆肏anks液洗滌，棄去上清，共洗2-3次。
?、菁尤肷倭亢宓呐囵B(yǎng)基吹打分散，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按適當(dāng)?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。
2、非酶消化法(EDTA消化法)
?、侔呀M織塊剪碎，呈1mm3大小的組織塊。
②將碎組織塊在平皿中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次。
③加入消化液(*或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間(中間可輕搖1~2次)，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。
?、軛壢ド锨?，加入含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應(yīng)，并洗滌2-3次后，加入*培養(yǎng)基。
?、萦梦艽荡颍辜?xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)過濾后分瓶培養(yǎng)。
(三)原代細(xì)胞培養(yǎng)
原代培養(yǎng)是直接從生物體獲取細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由于細(xì)胞剛剛從活體組織分離出來(lái)，故更接近于生物體內(nèi)的生活狀態(tài)。這一方法可為研究生物體細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、繁殖提供有力的手段，同時(shí)也為以后傳代培養(yǎng)創(chuàng)造條件。利用此方法還可直接服務(wù)于臨床實(shí)踐。例如，用從手術(shù)中切除的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，然后用該培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行抗癌藥物的篩選，根據(jù)腫瘤細(xì)胞對(duì)加入的*藥物的敏感性來(lái)幫助選擇有效的*方案，有可能起到增強(qiáng)療效、降低副作用的作用。
(四)原代細(xì)胞的傳代、保存
(1)傳代：依椐細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，生長(zhǎng)的細(xì)胞1：2或1：3進(jìn)行傳代。
(2)保存：DMSO+培養(yǎng)液+血清
按下列順序降溫：室溫→4℃(20分鐘)→冰箱冷凍室(30分鐘)→超低溫冰箱(-80℃ 過夜)→液氮。
(五)原代細(xì)胞的復(fù)蘇
(1)取出細(xì)胞，迅速放入37℃溫水中快速解凍。
(2)吸出細(xì)胞懸液，并加10倍以上培養(yǎng)液。
(3)用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后接種培養(yǎng)瓶，放入37℃ CO2 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
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