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質(zhì)譜技術(shù)在糖組學(xué)中的應(yīng)用

2018年10月08日 15:20

　　【中國儀器網(wǎng) 行業(yè)應(yīng)用】糖組學(xué)是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后的新興研究領(lǐng)域，主要研究聚糖結(jié)構(gòu)與功能。聚糖是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的第三類生物信息大分子，在廣泛的生物活性中扮演重要作用，是DNA-mRNA-蛋白質(zhì)信息流的延續(xù)。生物質(zhì)譜以其軟電離、高靈敏度、高分辨率、寬相對(duì)分子質(zhì)量檢測范圍和高通量等特點(diǎn)，很好地解決了高極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的生物大分子的分析難題，已成為蛋白質(zhì)和糖鏈研究中重要的分析手段之一。本文簡介質(zhì)譜技術(shù)在糖組學(xué)研究中的應(yīng)用。

　　糖組學(xué)的定義

　　糖基化是生物體內(nèi)廣泛的翻譯后修飾方式，這種修飾在半數(shù)的基因產(chǎn)物中都有發(fā)生。所有的細(xì)胞都包被有一層致密的聚糖，這一現(xiàn)象說明了糖生物學(xué)在細(xì)胞生命活動(dòng)中占有著重要地位。糖在生物過程中具有其它生物分子所不可替代的作用，但由于糖的結(jié)構(gòu)多樣性且不是基因的直接產(chǎn)物，所以，迄今尚沒有闡明糖的生物功能，而有關(guān)蛋白質(zhì)糖基化的功能及其分析方法也有很多問題尚待解決，這些都是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)所無法實(shí)現(xiàn)的. 因此糖生物學(xué)家在20 世紀(jì)末提出了糖組和糖組學(xué)概念，并得到科學(xué)家們的廣泛認(rèn)同，在后基因組時(shí)代的生命科學(xué)研究中成為新的前沿和熱點(diǎn)。受基因組和蛋白質(zhì)組定義的影響，糖組被定義為單一生物體中全部聚糖的總稱，糖組學(xué)則是研究糖組結(jié)構(gòu)與功能的科學(xué)。但是，由于糖的種類太多，在操作上不可能一次就提取能囊括各種類型的糖類，所以，實(shí)際上很難得到一個(gè)完整的糖組，基于這個(gè)原因，在具體進(jìn)行糖組研究時(shí)，更多地是研究“亞”糖組，例如糖蛋白質(zhì)組、糖脂組、糖胺聚糖組，乃至代謝產(chǎn)物中的糖苷組。

　　聚糖是生物信息大分子

　　人們已經(jīng)認(rèn)同聚糖是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的第三類生物信息大分子，在廣泛的生物活性中扮演重要作用，是DNA-mRNA-蛋白質(zhì)信息流的延續(xù)。盡管與DNA 攜帶遺傳信息或蛋白質(zhì)進(jìn)行酶催化反應(yīng)不同，但聚糖確實(shí)攜帶信息并具有重要的生物功能，在諸如細(xì)胞間通訊、蛋白折疊、細(xì)胞吸附和免疫識(shí)別等生物過程中都起核心作用。生物質(zhì)譜以其軟電離、高靈敏度、高分辨率、寬相對(duì)分子質(zhì)量檢測范圍和高通量等特點(diǎn)，很好地解決了高極性、難揮發(fā)、熱不穩(wěn)定的生物大分子的分析難題，已成為蛋白質(zhì)和糖鏈研究中重要的分析手段之一，有力促進(jìn)了生物組學(xué)的發(fā)展。

　　質(zhì)譜技術(shù)及其原理

　　質(zhì)譜(Mass Spectromet ry)是帶電原子、分子或分子碎片按質(zhì)荷比(或質(zhì)量)的大小順序排列的圖譜。質(zhì)譜儀是一類能使物質(zhì)粒子離化成離子并通過適當(dāng)?shù)碾妶?、磁場將它們按空間位置、時(shí)間先后或者軌道穩(wěn)定與否實(shí)現(xiàn)質(zhì)荷比分離，并檢測強(qiáng)度后進(jìn)行物質(zhì)分析的儀器。質(zhì)譜儀主要由分析系統(tǒng)、電學(xué)系統(tǒng)和真空系統(tǒng)組成。

　　用于分析的樣品分子(或原子)在離子源中離化成具有不同質(zhì)量的單電行分子離子和碎片離子，這些單電荷離子在加速電場中獲得相同的動(dòng)能并形成一束離子，進(jìn)入由電場和磁場組成的分析器，離子束中速度較慢的離子通過電場后編轉(zhuǎn)大，速度快的偏轉(zhuǎn)小；在磁場中離子發(fā)生角速度矢量相反的偏轉(zhuǎn)，即速度慢的離子依然偏轉(zhuǎn)大，速度快的偏轉(zhuǎn)?。划?dāng)兩個(gè)場的偏轉(zhuǎn)作用彼此補(bǔ)償時(shí)，它們的軌道便相交于一點(diǎn)。與此同時(shí)，在磁場中還能發(fā)生質(zhì)量的分離，這樣就使具有同一質(zhì)荷比而速度不同的離子聚焦在同一點(diǎn)上，不同質(zhì)荷比的離子聚焦在不同的點(diǎn)上，其焦面接近于平面，在此處用檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測即可得到不同質(zhì)荷比的譜線，即質(zhì)譜。通過質(zhì)譜分析，我們可以獲得分析樣品的分子量、分子式、分子中同位素構(gòu)成和分子結(jié)構(gòu)等多方面的信息。

　　質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展

　　質(zhì)譜的開發(fā)歷史要追溯到20 世紀(jì)初J .J .Thomson 創(chuàng)制的拋物線質(zhì)譜裝置，1919 年Aston 制成了臺(tái)速度聚焦型質(zhì)譜儀，成為了質(zhì)譜發(fā)展*的里程碑。初的質(zhì)譜儀主要用來測定元素或同位素的原子量，隨著離子光學(xué)理論的發(fā)展，質(zhì)譜儀不斷改進(jìn),其應(yīng)用范圍也在不斷擴(kuò)大，到20 世紀(jì)50 年代后期已廣泛地應(yīng)用于無機(jī)化合物和有機(jī)化合物的測定?，F(xiàn)今，質(zhì)譜分析的足跡已遍布各個(gè)學(xué)科的技術(shù)領(lǐng)域，在固體物理、冶金、電子、航天、原子能、地球和宇宙化學(xué)、生物化學(xué)及生命科學(xué)等領(lǐng)域均有著廣闊的應(yīng)用。質(zhì)譜技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，更為質(zhì)譜的發(fā)展注入了新的活力，形成了*的生物質(zhì)譜技術(shù)。

　　電噴霧質(zhì)譜技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)是誕生于80 年代末期的兩項(xiàng)軟電離技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的出現(xiàn)使傳統(tǒng)的主要用于小分子物質(zhì)研究的質(zhì)譜技術(shù)發(fā)生了革命性的變革。它們具有高靈敏度和高質(zhì)量檢測范圍，使得在pmol(10-12)甚至fmol(10-15)的水平上準(zhǔn)確地分析分子量高達(dá)幾萬到幾十萬的生物大分子成為可能，從而使質(zhì)譜技術(shù)真正走入了生命科學(xué)的研究領(lǐng)域，并得到迅速的發(fā)展。以下主要介紹與生物醫(yī)學(xué)有關(guān)的幾項(xiàng)質(zhì)譜技術(shù)。

　　質(zhì)譜技術(shù)在糖組學(xué)的應(yīng)用

　　（1）基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行質(zhì)譜

　　當(dāng)前，基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight,MALDI-TOF)在蛋白質(zhì)組研究中扮演著主要的角色。MALDI-TOF-MS具有從非衍生分子中獲得離子的能力，正確反映糖蛋白的構(gòu)成，同時(shí)方便與其他技術(shù)，如HPLC、GC或外切糖苷酶結(jié)合，提供更多的結(jié)構(gòu)信息。但是MALDI-TOF的分辨率和質(zhì)量精度較低，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)鑒定的不確定性，同時(shí)會(huì)引起分子中較弱的鍵斷裂，引起糖鏈部分或全部丟失，糖鏈的定位信息和結(jié)構(gòu)信息就會(huì)丟失，所以MALDI-TOF在糖組學(xué)研究中還存在遺憾。

　　（2）傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜

　　高分辨率、高質(zhì)量精度的傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry，F(xiàn)T-ICR-MS)吸引了研究者的注意。1974年Comisarow等發(fā)明了FT-ICR-MS，幾經(jīng)改進(jìn)，直到Henry等將電噴霧離子化技術(shù)(electrospray ionization,ESI)引入FT-ICR-MS才真正開啟了高精度生物學(xué)分析的大門。ESI高靈敏度改進(jìn)，如microelectrospray和nanoelectrospray,FT-ICR-MS可以分析真正生物水平(nmol)的生物樣品。FT-ICR-MS也受到糖組學(xué)研究的關(guān)注。FT-ICR-MS多重的*的分裂技術(shù)碰撞活化的分裂，紅外線多管子分裂以及電子捕獲分裂，可以確定后修飾的位置和修飾的結(jié)構(gòu)。ECD劈開氨基酸珠簾而不影響后修飾部分，可以后修飾的結(jié)構(gòu)信息。

　　（3）串聯(lián)質(zhì)譜

　　為了研究一些在血清/血漿或者與疾病相關(guān)的組織中表達(dá)的聚糖的結(jié)構(gòu)信息，串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)引起了研究者們的廣泛關(guān)注。由于糖聚合物是以一組與核心結(jié)構(gòu)相關(guān)的糖基化變體的形式存在的，所以對(duì)于一種聚糖混合物，它的分子量反映了其一組位點(diǎn)異構(gòu)體。要研究聚糖的結(jié)構(gòu)信息，一種方法是在質(zhì)譜分析之前先純化聚糖，但由于上述的一些原因，很多情況下是無法做到的,另一種方法是用串聯(lián)質(zhì)譜直接分析聚糖。串聯(lián)質(zhì)譜*行質(zhì)量分離，篩選出某一種離子，在MA與ESA之間進(jìn)行次碰撞活化，高能量的離子產(chǎn)生出一級(jí)子離子；再由ESA從一級(jí)子離子中篩先出某一種離子，它經(jīng)減速后在一級(jí)Q中進(jìn)行第二次碰撞活化，產(chǎn)生低能量碰撞誘導(dǎo)分解產(chǎn)物(二級(jí)子離子)，二級(jí)子離子再通達(dá)二級(jí)Q進(jìn)行分析，由于在此系統(tǒng)中同時(shí)檢測了高、低能量碰撞的誘導(dǎo)分解產(chǎn)物，因此可獲得較全面的離子信息。

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