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　　【中國儀器網(wǎng) 行業(yè)應(yīng)用】質(zhì)譜(mass spectrometry，MS)技術(shù)是一種重要的檢測分析技術(shù)，通過將待測樣本轉(zhuǎn)換成高速運(yùn)動的離子，根據(jù)不同的離子擁有不同的質(zhì)荷比(m/z)進(jìn)行分離和檢測目標(biāo)離子或片段，然后依據(jù)保留時間和其豐度值進(jìn)行定性和定量。近年來，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，通過改進(jìn)離子源和分離器相繼發(fā)展了多種類型的質(zhì)譜儀如電噴霧離子源質(zhì)譜(ESI-MS)、大氣壓化學(xué)電離離子源質(zhì)譜(APCI-MS)、四級桿(Q)質(zhì)譜儀、離子阱質(zhì)譜技術(shù)以及各種串聯(lián)、聯(lián)用質(zhì)譜儀等多種類型，*提高了檢測的分辨率和檢測范圍。質(zhì)譜技術(shù)先應(yīng)用于計(jì)量和分析化學(xué)領(lǐng)域，在臨床檢驗(yàn)中質(zhì)譜仍屬于一種年輕的檢測方法。但自從其在臨床檢驗(yàn)應(yīng)用以來，便以其高靈敏度、低檢測限、樣本用量少、高通量、檢測速度快、樣本前處理簡單的優(yōu)勢顯示出巨大的生命力，尤其和氣相、液相色譜儀的聯(lián)用*的擴(kuò)展了質(zhì)譜技術(shù)在臨床檢驗(yàn)中的分析范圍。
 

　　一、質(zhì)譜儀的組成
 

　　質(zhì)譜儀主要有5個部分組成：進(jìn)樣系統(tǒng)、離子源、質(zhì)量分析器、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。其核心部件是離子源和質(zhì)量分析器。離子源的功能是將由進(jìn)樣系統(tǒng)引入的樣本分子轉(zhuǎn)化成離子，包括硬電離方法和軟電離方法。硬電離方法給予樣本較大的能量，如電子轟擊電離、化學(xué)電離、場致離子化電離等;軟電離方法是一種比較溫和的離子化方式，包括快原子轟擊電離、大氣壓化學(xué)電離、大氣壓光致電離、電噴霧電離、基質(zhì)輔助激光解吸電離等類型。硬電離方法適用于一些小分子化合物的分析，軟電離適用于分子量較大的化合物，尤其是一些生物分子，如蛋白質(zhì)、多肽、寡聚核苷酸等。質(zhì)量分析器主要是將電離產(chǎn)生的離子根據(jù)其不同的質(zhì)荷比來分離目標(biāo)離子，其主要類型有單聚焦、雙聚焦、擺線、磁分析器、飛行時間、四級桿質(zhì)量分析器、離子阱分析器、傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜等類型。此外儀器還需要在高真空環(huán)境中進(jìn)行離子分離，因此真空系統(tǒng)也是質(zhì)譜儀*的組成部分。
 

　　二、質(zhì)譜儀的工作原理
 

　　質(zhì)譜儀的基本工作原理：待測樣本由進(jìn)樣系統(tǒng)進(jìn)入離子源內(nèi)電離成離子進(jìn)入質(zhì)量分析器，然后質(zhì)量分析器據(jù)形成的離子的m/z進(jìn)行分離，后進(jìn)入檢測器檢測，數(shù)據(jù)系統(tǒng)將離子信號轉(zhuǎn)換成譜圖進(jìn)行質(zhì)譜解析或定量分析。目前生命科學(xué)領(lǐng)域中的質(zhì)譜儀大都由幾種質(zhì)量檢測器串聯(lián)組成，這樣可以提高離子分離效率，使檢測更具特異性和準(zhǔn)確度。
 

　　三、質(zhì)譜儀在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用
 

　　(一)在微生物檢驗(yàn)方面的應(yīng)用
 

　　傳統(tǒng)的致病微生物檢測大多采用微生物培養(yǎng)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)的方法檢測，不僅分析周期長而且沒有明確的種群分型標(biāo)準(zhǔn)，往往造成分析結(jié)果的滯后和種類分型的誤判。據(jù)估計(jì)，在臨床實(shí)驗(yàn)室中僅在鏈球菌的分類中，就有高達(dá)13%的辨別錯誤。近年來，質(zhì)譜技術(shù)在微生物檢驗(yàn)方面的應(yīng)用越來越多，這主要得益于其得天獨(dú)厚的優(yōu)勢：(1)可用于多種微生物樣本，如痰液、血液、尿液、腦脊液和胸腹腔積液以及經(jīng)過培養(yǎng)的樣本;(2)可用于幾乎所有類型的病原體鑒定和分類檢測，如細(xì)菌、真菌及其孢子、病毒、寄生蟲等;(3)可對病原的多種成分進(jìn)行分析，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、脂多糖、脂寡糖、DNA、多肽及其他可被離子化的分子;(4)檢測速度快，例如一個病原微生物的質(zhì)譜檢定實(shí)驗(yàn)，包括樣本的采集和制備，整個過程不到10 min;(5)樣本用量少;(6)樣本前處理簡單;(7)特異性和準(zhǔn)確性高，例如*的表型鑒定，Rajakaruna等利用基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時間質(zhì)譜(SELDI-TOF-MS)技術(shù)分析了來自臨床實(shí)驗(yàn)室的95個分離群和39個葡萄球菌群，并利用MicrobeLynx軟件成功的識別了各個種群;(8)高敏感性，例如液相串聯(lián)質(zhì)譜可以檢測到10~100個細(xì)菌或20~50個孢子的存在。在對生物樣本進(jìn)行處理后，甚至可以在單個菌水平發(fā)現(xiàn)并確定致病菌，使其在微生物尤其是傳染病病原體鑒定方面具有巨大的優(yōu)勢。近年來已建立了微生物胞膜蛋白質(zhì)、脂多糖、核酸等的指紋數(shù)據(jù)庫，使其檢測更加準(zhǔn)確和快速。
 

　　目前在細(xì)菌檢測中應(yīng)用較多是飛行質(zhì)譜技術(shù)。通過檢測細(xì)菌胞膜成分或表達(dá)的特異蛋白對細(xì)菌進(jìn)行種群的鑒別，不僅可以識別病原菌，而且有助于發(fā)現(xiàn)新的病原菌。此外還有用于病原體的藥物敏感性實(shí)驗(yàn)檢測和真菌檢測研究等。
 

　　(二)質(zhì)譜技術(shù)在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)的應(yīng)用
 

　　飛行質(zhì)譜技術(shù)的全稱是表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，SELDI-TOF-MS)，是利用相同能量的帶電粒子，由于質(zhì)量的差異而具有不同速度從而以不同時間通過相同的漂移距離到達(dá)接收器，依據(jù)離子束到達(dá)檢測器的時間推算出m/z，從而進(jìn)行定性和定量檢測。其高靈敏度、高通量的分析特點(diǎn)使其在臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)生物標(biāo)志物檢測方面成為一項(xiàng)有力的工具，篩選作用*。如前列腺癌及前列腺增生、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、肺癌、肝癌、腎癌、結(jié)腸癌、喉癌、鼻咽癌、食道癌等，都發(fā)現(xiàn)了特異的蛋白或某些蛋白的增加或者減少。尤其質(zhì)譜檢測技術(shù)在泌尿系統(tǒng)中的應(yīng)用發(fā)展迅速。由于其檢測的樣本為尿液，對患者身體不造成傷害，不僅可以早期診斷腎臟疾病，而且避免或減輕了傳統(tǒng)侵入性方法如腎臟活檢等給患者帶來的痛苦，提高患者治療的依從性和存活率。在腎臟腫瘤、糖尿病性腎臟病變、腎臟移植功能檢測等具有很大應(yīng)用前景。此外毛細(xì)管電泳質(zhì)譜技術(shù)被廣泛用于泌尿系統(tǒng) peptidomical 生物標(biāo)志物的研究，驗(yàn)證了許多已經(jīng)報(bào)道的但是沒有蛋白和肽段識別的研究結(jié)果。
 

　　Agger等采用液相色譜-多重反應(yīng)檢測-質(zhì)譜(LC-MRM/MS)方法通過同時定量測定血漿樣本中載脂蛋白A-Ⅰ和載脂蛋白B來推進(jìn)質(zhì)譜方法同時定量多種血漿/血清中蛋白質(zhì)在臨床前期的生物標(biāo)志物大規(guī)模篩選以及取代價(jià)格昂貴的免疫測定方法作為實(shí)驗(yàn)室檢查的常規(guī)方法的應(yīng)用。結(jié)果表明LC-MRM/MS與傳統(tǒng)免疫學(xué)方法相關(guān)性良好且具有大規(guī)模應(yīng)用于臨床研究的可行性。因其簡化了樣本的前處理以及樣本前處理中蛋白消化作用帶來的變異，具有潛在的應(yīng)用前景。
 

　　(三)在臨床生物化學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用
 

　　1.在體內(nèi)激素檢測方面的應(yīng)用 質(zhì)譜技術(shù)在臨床生物化學(xué)中一項(xiàng)重要的應(yīng)用是用于體內(nèi)激素的檢測，如類固醇激素(甾體激素)及其代謝產(chǎn)物的檢測，具有極重要的臨床診斷價(jià)值，幾乎可以診斷所有的類固醇相關(guān)障礙性疾病。如睪酮(T)、雙氫睪酮(DHT)、血漿雌酮硫酸鹽、雌酮、雌二醇和雌三醇等的定量檢測，可輔助多種激素相關(guān)疾病及激素替代治療疾病如兒科遺傳性激素相關(guān)疾病、先天性腎上腺增生癥、家族性高醛甾酮過多癥、多囊卵巢病、成人生殖系統(tǒng)和第二性征的維持、前列腺增生和前列腺癌、原發(fā)性醛固酮增多癥、腎上腺機(jī)能減退、雌激素缺乏及抗雌激素藥治療、腎上腺功能異常(如Cushing's綜合癥)的診斷、監(jiān)測、治療和研究等。
 

　　2.在血藥濃度監(jiān)測和藥物代謝研究中的應(yīng)用 臨床中某些藥物效用范圍比較窄，很容易引起毒性反應(yīng)，造成不良后果。如免疫抑制劑隨著器官移植技術(shù)和移植成活率的提高越來越多的應(yīng)用于患者，其在人體內(nèi)過多和過少都會給患者帶來很大的痛苦。但這些藥物在體內(nèi)的濃度往往很低，給檢測帶來一定的困難。近幾年隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，其高靈敏度、高特異性和檢測速度快的優(yōu)勢使其已成為藥物濃度檢測的重要工具。特別是在免疫抑制藥物、抗腫瘤藥物、抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(HIV)藥物、抗精神病藥物、一些激素類藥物、中藥及其天然產(chǎn)物分析、藥物濫用(如*、鴉片和一些鎮(zhèn)痛藥)、麻醉藥、中毒藥物的急救中得到廣泛應(yīng)用，并且質(zhì)譜技術(shù)被*為生物樣本中藥物及其代謝產(chǎn)物檢測的標(biāo)準(zhǔn)化方法。此外有報(bào)道通過用飛行質(zhì)譜方法進(jìn)行單鏈核苷酸多態(tài)性的快速基因分型從而指導(dǎo)*(抗凝血藥)用量的研究。這為新的多重基因分型方法提供了一個非常好的臨床檢驗(yàn)平臺，促進(jìn)個體化藥物治療的研究。
 

　　3.在遺傳性疾病檢測中的應(yīng)用 質(zhì)譜技術(shù)在遺傳性疾病的診斷和篩查中應(yīng)用廣泛。為大家熟知的就是質(zhì)譜技術(shù)在新生兒篩查檢測中的應(yīng)用，通過檢測氨基酸、脂肪酸、有機(jī)酸及其代謝產(chǎn)物可以靈敏、準(zhǔn)確地檢測出20多種遺傳代謝疾病，從而早期診斷、早期治療，挽救了很多患兒的生命和人生。還有報(bào)道質(zhì)譜技術(shù)用于快速篩查嘌呤和嘧啶代謝紊亂高?；颊叩难芯?，快速且特異，彌補(bǔ)了該種遺傳病表型表現(xiàn)多樣性和非特異性給診斷帶來的困難。孫衛(wèi)華等采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)測定尿琥珀酰丙酮(SA)，性和準(zhǔn)確性均較高，為臨床上鑒別診斷*血癥I型提供了新的方法。
 

　　4.痕量元素/微量營養(yǎng)素檢測中的應(yīng)用 電感耦合等離子體質(zhì)譜分析技術(shù)(ICP-MS)是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的無機(jī)元素分析檢測技術(shù)，近年來在痕量、超痕量成分及同位素分析檢測中廣泛應(yīng)用。ICP-MS是在樣本處理前加入待測元素的同位素，利用其測定前后的豐度比例改變而達(dá)到測定目的?？梢酝瑫r測定多種痕量元素，具有檢測限低、動態(tài)線性范圍寬、干擾少、穩(wěn)定性好、分析精密度高、速度快、樣本前處理簡單、高通量等諸多優(yōu)點(diǎn)，是準(zhǔn)確的無機(jī)元素分析方法之一。目前已廣泛應(yīng)用于血清、全血、尿液以及頭發(fā)中鉛(Pb)、砷(As)、鐵(Fe)、硒(Se)、鋅(Zn)等有害重金屬元素和人體微量元素的測定，可輔助臨床疾病和職業(yè)病的診斷和鑒別診斷等。但是其一個大的缺點(diǎn)是昂貴的耗費(fèi)以及某些重金屬元素比如鉻和鐵等有較多的干擾。此外，質(zhì)譜技術(shù)還可應(yīng)用于人體微量營養(yǎng)元素的檢測，如B12、*等，對于診斷人體相關(guān)微量營養(yǎng)素異常導(dǎo)致的疾病具有重要臨床應(yīng)用意義。
 

　　5.糖化血紅蛋白的檢測應(yīng)用 糖化血紅蛋白(HbA1c)被認(rèn)為是診斷糖尿病的好指標(biāo)。Nakanishi等報(bào)道用電噴霧電離質(zhì)譜法(ESI-MS)檢測HbA1c并與傳統(tǒng)方法比較，結(jié)果顯示ESI-MS方法與傳統(tǒng)方法的相關(guān)性高于96%，而且重復(fù)性非常好，在臨床檢驗(yàn)常規(guī)方法的質(zhì)量控制中可以起到很大作用。
 

　　(四)在分子生物診斷中的應(yīng)用
 

　　1.蛋白組學(xué)和核苷酸多態(tài)性的研究應(yīng)用 質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域中的另一個重要方面是蛋白質(zhì)組學(xué)研究。2002年軟電離技術(shù)被授予諾貝爾化學(xué)獎。生物質(zhì)譜技術(shù)也成為質(zhì)譜學(xué)中具有活力的前沿?zé)衢T技術(shù)。其可以檢測蛋白質(zhì)的氨基酸組成、分子量、多肽或二硫鍵的數(shù)目和位置及蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象等;還用于檢測核酸的分子量和單核苷酸多態(tài)性(即基因位點(diǎn)的突變)研究。其準(zhǔn)確、靈敏和高通量的特點(diǎn)已經(jīng)成為檢測蛋白及多肽分子和基因的重要技術(shù)。通過MALDI-TOF-MS檢測尋找特異的一組蛋白質(zhì)峰，建立腫瘤早期血清差異表達(dá)蛋白的診斷模型，對早期快速診斷腫瘤提供可能。已有研究報(bào)道用于多種腫瘤的早期診斷。單核苷酸多態(tài)性是指DNA序列上發(fā)生的單個核苷酸堿基之間的變異，在人群中的發(fā)生頻率>1%，是決定疾病易感性和藥物反應(yīng)性差異的重要因素。通過檢測突變的位點(diǎn)可以對疾病進(jìn)行預(yù)測，提供診斷意見和用藥指導(dǎo)并探討與疾病發(fā)生的相關(guān)性。因?yàn)镸ALDI-TOF-MS檢測的是核苷酸本身的分子量，相較于傳統(tǒng)的單核苷酸多態(tài)性分型檢測方法更為省時、省力和可靠。
 

　　2.代謝組學(xué)研究的應(yīng)用 人體是一個復(fù)雜的生化大工廠。當(dāng)某部件出現(xiàn)異常時必然會伴隨著某些代謝小分子的水平異常。相對來說這些小分子比DNA、RNA、蛋白質(zhì)等更能反應(yīng)一個細(xì)胞當(dāng)前的功能狀態(tài)。代謝組學(xué)也是目前研究的一個熱點(diǎn)，質(zhì)譜技術(shù)在檢測這些代謝小分子的變化上也有重要的應(yīng)用，為多種疾病及腫瘤的更早期診斷和指導(dǎo)治療提供依據(jù)。如張文亮等采用毛細(xì)管電泳與MALDI-TOF-MS聯(lián)用測定血清轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白的化學(xué)修飾，為進(jìn)一步探索淀粉樣變性的發(fā)病機(jī)制提供了一種簡便的檢測方法。
 

　　(五)在參考方法建立和研制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)方面的應(yīng)用
 

　　在臨床檢驗(yàn)中基于準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)化檢測是目前急需的。1997年物質(zhì)量咨詢委員會(CCQM)將同位素稀釋質(zhì)譜(ED-ID-MS)原理定為一級(基準(zhǔn))測量原理之一，其同時具有質(zhì)譜分析的高度特異性和同位素稀釋的高度精密性，且測量的動態(tài)范圍寬，樣本制備不需嚴(yán)格定量操作，測量值能夠直接溯源到單位制的物質(zhì)量基本單位“摩爾”。因此基于同位素稀釋質(zhì)譜原理的方法在生物和臨床化學(xué)溯源研究中受到越來越多的重視，為臨床檢驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制提供了技術(shù)保障，是臨床檢驗(yàn)參考方法的佳選擇。
 

　　Thienpont 等建立基于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的ED-ID-MS法檢測游離T3和T4通過IFCC的候選傳統(tǒng)參考測量程序方法的校準(zhǔn)和溯源，檢測指標(biāo)都取得了很好的相關(guān)性。張傳寶應(yīng)用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法建立了測定血清尿酸的候選參考方法。
 

　　四、結(jié)語
 

　　質(zhì)譜技術(shù)，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)可以提供物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和質(zhì)量信息。因此其在定性和定量生物樣本中的作用越來越大，同時也適合一些探索性的工作。MALDI-TOF和SELDI質(zhì)譜儀近來被廣泛用于一些標(biāo)志性物質(zhì)的探索。三重四級桿線性離子阱分析器的發(fā)展使分析器定量的能力與離子阱的掃描能力相結(jié)合，從而可以容納掃描器組合的不同排列。選擇性反應(yīng)物探測的組合和三重質(zhì)譜技術(shù)的組合(MS/MS/MS)是一個定量的很好組合。電噴霧離子化、大氣壓光致電離是近年來發(fā)展迅速的離子源，可以檢測極性和非極性化合物。
 

　　質(zhì)譜技術(shù)雖然有很多的優(yōu)點(diǎn)，在近年來很多領(lǐng)域的應(yīng)用也發(fā)展迅速，但其也有自身的瓶頸：如沒有某純物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)或特征性的離子碎片，則難以判斷該物質(zhì)是何種物質(zhì)，無法定性和定量，所以目前還有許多物質(zhì)無法用質(zhì)譜檢測，尤其是一些大分子的復(fù)雜物質(zhì);目前質(zhì)譜技術(shù)的自動化程度還還相對較差，前處理過程也相對復(fù)雜，其對工作人員的技術(shù)要求較高;另外儀器昂貴，日常運(yùn)行費(fèi)用及維護(hù)費(fèi)用也較高，如ID-MS儀器，在處理樣本時需要加入適量的同位素稀釋劑，該種稀釋劑來源較困難，制備成本較高等，這些都為ID-MS的普及應(yīng)用帶來困難;此外該技術(shù)的高敏感性，如SELDI-TOF-MS技術(shù)篩檢蛋白的高敏感性必然帶來了檢測的假陽性，這也是該技術(shù)不容忽視的一個弱點(diǎn)。但相信隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展成熟，其在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測中會有更廣泛的應(yīng)用。