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　　智立中特(武漢)生物科技有限公司主要致力于質(zhì)粒微生物資源的保護、共享和持續(xù)利用，圍繞我國生命科學研究、生物技術創(chuàng)新和產(chǎn)業(yè)發(fā)展等重大需求，探索、發(fā)現(xiàn)、收集國內(nèi)外的微生物資源，妥善長期保存管理;在保證生物安全和保護知識產(chǎn)權的前提下，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、衛(wèi)生健康、環(huán)境保護、科研教育提供質(zhì)粒載體物物種資源、基因資源、信息資源和專業(yè)技術服務。旗下質(zhì)粒載體網(wǎng)是一款提供質(zhì)粒載體展示及定制的專業(yè)型網(wǎng)站，由智立中特(武漢)生物科技有限公司聯(lián)合多家企業(yè)公司科研院校共同打造!主要展示了各種基因類型下的質(zhì)粒載體!

　　我們的工作主要包括：廣泛分離、收集、保藏、交換和供應各類微生物質(zhì)粒菌種;保存用于zhuan利程序的各種可培養(yǎng)生物材料;質(zhì)粒載體類保藏技術研究;微生物分離、培養(yǎng)技術研究;微生物鑒定和復核技術研究;保藏菌種的資料情報收集和提供及編輯微生物菌種目錄。

　　一、貼壁細胞的傳代所需材料

　　· 裝有貼壁細胞的培養(yǎng)容器

　　· 經(jīng)過組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿

　　· 完quan生長培養(yǎng)基，預熱至 37℃

　　· 一次性無菌15ml試管

　　· 37℃ 培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為 5% 的濕化空氣

　　· 平衡yan溶液，例如：杜爾貝科磷酸鹽緩沖液 (DPBS)，不含鈣、鎂和酚紅

　　· 消化酶，例如：胰蛋白mei，不含酚紅

　　二、貼壁細胞傳代流程

　　細胞培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風30min，操作前需要換細胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實驗服，戴上一次性口罩和帽子，整個無菌操作都應該在酒精燈的周圍進行。

　　1. 取對數(shù)生長期的貼壁細胞，棄掉舊培養(yǎng)基。

　　2. 用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗細胞1-2遍。 (每10 cm2 培養(yǎng)表面積需要2 ml 溶液)。從與貼壁細胞層相對的容器一側輕輕加入沖洗液，以避免攪動細胞層，前后搖晃容器數(shù)次。

　　注：沖洗步驟可去除可能抑制消化酶作用的少量血清、鈣和鎂。

　　3. 從培養(yǎng)容器中吸出沖洗液并丟棄。

　　4. 向培養(yǎng)瓶中加入預熱的消化酶(例如：胰蛋白mei);試劑量應足以覆蓋細胞層 (每10 cm2 大約0.5ml)。輕輕搖晃容器，使試劑wan全覆蓋細胞層。

　　5. 將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約2分鐘。

　　請注意，實際孵育時間根據(jù)所用細胞系不同可能有所差異。

　　6. 在顯微鏡下觀察細胞解離情況。如果解離程度未達90%，可將孵育時間延長幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細胞解離。

　　7. 細胞解離程度大于等于90%時，傾斜培養(yǎng)容器，使細胞上液體盡快流盡。加入所用消化酶兩倍體積的預熱wan全生長培養(yǎng)基。輕柔吹打細胞層表面數(shù)次，使細胞分散，成為單細胞懸液。

　　8. 將細胞轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管中，200g 離心5至10分鐘。

　　請注意，離心速度和時間依細胞種類不同而有所差異。

　　9. 用最少體積的預熱wan全生長培養(yǎng)基重新懸浮細胞沉淀。

　　注：此時可進行細胞計數(shù)

　　10.將細胞懸液稀釋到該細胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細胞懸液轉(zhuǎn)移到新的細胞培養(yǎng)容器中，把細胞放回培養(yǎng)箱。

　　注：如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋。

　　三、懸浮細胞的傳代

　　懸浮細胞傳代比貼壁細胞傳代稍微簡單一些。由于細胞已經(jīng)在生長培養(yǎng)基中懸浮，因此無需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，整個過程較為迅速，對細胞的損傷也較小。懸浮生長細胞的傳代培養(yǎng)要比貼壁細胞簡單得多，通常有兩種方法。

　　1.直接給帶傳代的培養(yǎng)瓶中補充一定量的新鮮培養(yǎng)基，然后將進行分裝。

　　2.先通過離心棄掉營養(yǎng)匱乏的舊培養(yǎng)基，然后再用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細胞沉淀，最后將其分裝至培養(yǎng)瓶中即可。

　　懸浮細胞傳代后的延滯期一般比貼壁細胞短。

　　四、所需材料

　　• 裝有懸浮細胞的培養(yǎng)容器

　　• 完quan生長培養(yǎng)基，預熱至37℃

　　• 37℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣

　　五、懸浮細胞傳代流程

　　所有與細胞接觸的溶液和設備均應為無菌狀態(tài)。必須采用正確的無菌技術，并且在超凈臺內(nèi)進行。傳代應在細胞處于對數(shù)期、未達到匯合狀態(tài)時進行。達到匯合狀態(tài)時，懸浮培養(yǎng)的細胞會聚集成團塊，轉(zhuǎn)動培養(yǎng)瓶時培養(yǎng)基會變得渾濁。傳代前所建議的zui大細胞密度隨細胞系不同而有所差異;詳細信息請參閱針對具體細胞的產(chǎn)品說明書或操作手冊。

　　六、懸浮細胞的傳代方法有2種

　　1、直接傳代法：

　　①待懸浮細胞長滿至80%-90%左右(細胞懸液變黃)，即可傳代;

　?、谟梦芪鼦壖毎麘乙?/2～2/3;

　?、奂尤脒m量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

　　2、離心傳代法：

　?、賹⒓毎麘乙恨D(zhuǎn)移到離心管內(nèi);

　　②150g離心5min，棄上清;

　　③使用新鮮的培養(yǎng)基重懸細胞;

　?、芪芪∵m量細胞懸液，裝入新的培養(yǎng)瓶，再加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。