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基于Obitrap超高分辨質(zhì)譜平臺的多肽藥物特立帕肽的定量分析

來源:賽默飛色譜及痕量元素分析   2020年12月02日 14:41  
  前言: 多肽藥物是介于大分子蛋白/抗體類藥物和小分子藥物之間的一 類重要的藥物分子,因其生物活性高、靶向?qū)R恍愿摺⑦x擇性 高、毒副作用低等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于疾病治療領(lǐng)域[1]。Thermo Obitrap因其超高的分辨率,質(zhì)量軸穩(wěn)定性,已經(jīng)廣泛應(yīng)用 在了多肽藥物結(jié)構(gòu)表征中。Obitrap 作為高分辯還具有*靈敏 度和線性范圍,因此也被越來越多的應(yīng)用到藥物的定量研究中 [2,3]。
 
  PTH 是甲狀旁腺主細(xì)胞分泌的由84個氨基酸組成的多肽類 激素,其對于維持鈣磷代謝的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用。 特立帕肽(SVSEIQLMHNLGKHLNSMERVEWLRKKLQDVHNF,4117.7 Da)是一種人工重組合成的人PTH 1-34多 肽,是第yi個被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)批準(zhǔn)的抗骨質(zhì)疏松性骨折的骨合成藥物 [3]。 Thermo Scientific Q Exactive Focus 四極桿 Orbitrap 組合型質(zhì) 譜儀專為常規(guī)分析應(yīng)用而設(shè)計,高分辨率為7萬,大分辨 率12Hz,可以在同一系統(tǒng)中同時實現(xiàn)準(zhǔn)確可靠的定性和定量分 析。 Obitrap Fusion Lumos是賽默飛世爾科技在2015年推出的三合 一的靜電場軌道阱超高分辨質(zhì)譜儀。Lumos搭載的分段式四級 桿技術(shù)(Advanced Quadrupole Technology,AQT)使離子傳 輸效率至少提高了 2 倍,超高場的Obitrap擁有50萬分辨率和 20Hz的超快掃描速度,使Lumos在具有高靈敏度同時,還 擁有穩(wěn)定性和動態(tài)范圍。 本實驗將基于兩款Obitrap高分辯質(zhì)譜Q Exactive Focus和Obitrap Fusion Lumos建立多肽藥物特立帕肽的定量分析方法,考 察高分辯質(zhì)譜Obitrap的定量能力。
 
  實驗條件 樣品配置: 稱取特立帕肽粉末,加水稀釋成5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。用 含5%乙腈,0.1μg/μL BSA,1%甲酸的稀釋劑,逐級稀釋特立 帕肽標(biāo)準(zhǔn)品,配置成標(biāo)準(zhǔn)曲線。 色譜條件: 液相系統(tǒng)為:Thermo Vanquish Flex液相色譜儀,色譜柱為Thermo AccucoreTM 150 C18(50×2.1mm,2.6um,貨號16126-052130) ;柱溫:45℃;流動相及梯度系統(tǒng)程序見表1
 
  血漿樣品前處理: 取150μL的人空白血漿,加入15μL的特立帕肽工作液,震蕩混 勻。按體積比1:6加入含75%乙腈,0.1% FA的沉淀劑后,充 分震蕩。6500g離心5min,取上清后,40℃揮干。揮干樣品 用150μL含10% ACN,90%水,1% FA的復(fù)溶劑復(fù)溶,充分震 蕩,14000g離心5min,取上清,上樣5μL進(jìn)行分析。 數(shù)據(jù)分析: 所有數(shù)據(jù)分析均使用Thermo Scientific™ TraceFinder™ 軟件完 成。TraceFinder平臺包含了儀器控制,方法開發(fā),數(shù)據(jù)定性定 量批處理等功能。提峰時質(zhì)量偏差為±5ppm。 實驗結(jié)果 1、特立帕肽標(biāo)準(zhǔn)品在Focus,Lumos上的線性與準(zhǔn)確度。 用稀釋劑(含0.1ug/μL BSA,1% FA,5% ACN)的稀釋劑逐級 稀釋特立帕肽標(biāo)準(zhǔn)品,配置成一系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品,上樣分析。 結(jié)果表明,F(xiàn)ocus對特立帕肽的定量下限為50 pg/mL(圖1), 上樣5μL,上柱約60 amol,標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好,R2=0.997,標(biāo) 準(zhǔn)曲線各點回算的濃度在理論值的15%以內(nèi)(表4)。
 
  特立帕肽的LOQ點在Focus和Lumos上的提峰圖如圖3,峰型良 好,信噪比S/N>10,重復(fù)5針的RSD<10%(表6),表現(xiàn)出了 良好的穩(wěn)定性。
 
  2、特立帕肽血漿樣品在Lumos上的線性與準(zhǔn)確度。 同時在Lumos上考察了特例帕肽血漿樣品的定量下限。取150 μL的空白人血漿,加入一系列濃度梯度的特立帕肽標(biāo)準(zhǔn)品,配 置成血漿標(biāo)曲,用1:6體積的75% 乙腈沉淀后,離心去上清, 揮干,復(fù)溶后進(jìn)樣。 結(jié)果顯示,Lumos對于基質(zhì)復(fù)雜的血漿樣品仍表現(xiàn)出良好的線 性,精密度,穩(wěn)定性。特立帕肽低定量下限為50 pg/mL,線 性范圍50 pg/mL-50 ng/mL(圖4),1000倍的線性范圍,上柱 量約60 amol,標(biāo)曲各點Diff值 < 10%(表7)。
 
  結(jié)論: 本文分別在Obitrap Focus賽默飛四極桿-軌道阱質(zhì)譜儀,Lumos上建立了大分子多肽類藥物 特例帕肽的定量分析方法。結(jié)果表明,高分辯Obitrap對特立 帕肽表現(xiàn)出良好的定量能力,定量下限可以分別達(dá)到上柱60 amol,24 amol。同時,對于基質(zhì)更為復(fù)雜的血漿樣品,Lumos 上可以達(dá)到定量下限上柱60 amol,靈敏度滿足臨床上對特立帕 肽的檢測要求。Obitrap作為高分辨質(zhì)譜,在擁有超高分辨率的 同時,兼具出色的靈敏度和穩(wěn)定性,可以應(yīng)用大分子多肽類藥 物的定量分析與檢測。
 
  參考文獻(xiàn) [1] Lau J L, Dunn M K. Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends, and future directions[J]. Bioorganic & medicinal chemistry, 2018, 26(10): 2700-2707. [2] Dillen L, Cuyckens F. High-resolution MS: first choice for peptide quantification?[J]. Bioanalysis, 2013, 5(10): 1145-1148. [3] Kang L, Weng N, Jian W. LC–MS bioanalysis of intact proteins and peptides[J]. Biomedical Chromatography, 2019: e4633. [4] Quattrocchi E, Kourlas H. Teriparatide: a review[J]. Clinical therapeutics, 2004, 26(6): 841-854.

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