T4 DNA 連接酶 常用試劑
T4 DNA 連接酶 常用試劑產(chǎn)品說明:
該酶在以ATP 做輔酶的情況下,可以催化相鄰DNA 鏈的 5'-磷酸集團(tuán)和 3'-羥基之間的鏈接反應(yīng)。平末端和粘性末端均可。此酶液可以催化雙鏈 RNA 與雙鏈 DNA 連接,但不能催化單鏈核酸的連接。
活性單位定義:
1 個(gè) Weiss 活性單位是指在 ATP-PPi 交換反應(yīng)中,37℃ 、20min 內(nèi)將 1nmol[32PPi]轉(zhuǎn)換為 Norit 可吸收形式所需的酶量。1 個(gè) Weiss 活性單位相當(dāng)于約 200 個(gè)粘性末端連接單位。1 個(gè)粘性末端連接 單位 :20μL 反應(yīng)體系 ( 50mM Tris-HCl pH7.5 ) , 10mM MgCl2 , 10mM DTT, 1mM ATP,25μg/ml BSA,0. 12μM (300μg/ml 的 5'DNA 末端)中,在 16℃、30min 內(nèi) 50%連接 Hind III 酶切的 Lambda DNA 產(chǎn)物所需要的酶量。
注意事項(xiàng):
1 、載體 DNA 和連接片段的摩爾比:對于不同的載體和DNA 片段,要取得成功的連接,應(yīng)分別建立具有不同摩爾數(shù)比例的連接反應(yīng),在大多數(shù)情況下,DNA 片段的摩爾數(shù)應(yīng)控制在載體 DNA摩爾數(shù)的3- 10倍。
2 、10×T4 DNA Ligase Buffer 中含有 ATP,為避免 ATP 的降解,建議解凍后分裝凍存于-20℃。10×T4DNA Ligase Buffer 在融解時(shí),如果出現(xiàn)少量沉淀屬正?,F(xiàn)象,請顛倒混勻后使用。
3 、平末端的載體與 DNA 片段連接時(shí),應(yīng)首先對載體進(jìn)行去磷酸化,以防止載體自身環(huán)化。
注意:如果向反應(yīng)體系中加入 PEG 可以促進(jìn)平末端的連接,但 PEG 可能導(dǎo)致cDNA 片段克隆產(chǎn)物出現(xiàn)串聯(lián)體并抑制包裝的反應(yīng)。