PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優(yōu)于PicoGreen)
產(chǎn)品名稱(chēng) | 貨號(hào) | 規(guī)格 | 保存 | 價(jià)格(元) |
PikoGreen dsDNA quantitation reagent(優(yōu)于PicoGreen) | D1101L1123 | 1ml | 4℃ | 1650 |
PikoGreen dsDNA quantitation reagent使用方法
1. PikoGreen工作液的配制
使用前將PikoGreen dsDNA定量試劑回溫至室溫；PikoGreen是以100µL 200×的濃縮液形式保存于無(wú)水DMSO中的（共10管），實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求用1×TE按1:200 的比例稀釋適量定量試劑濃縮液。例如要準(zhǔn)備足夠的操作溶液以2ml檢測(cè)體系測(cè)定20個(gè)樣品，可向19.9mL 1×TE 中加入100μL PikoGreen dsDNA 定量試劑。工作液見(jiàn)光易降解，盡量在配好后幾小時(shí)內(nèi)使用。
2. 配制標(biāo)準(zhǔn)品DNA溶液
1) 用1 X TE溶液溶解dsDNA制備1μg/mL dsDNA 。根據(jù)在1cm 光程長(zhǎng)度的比色杯中A260nm時(shí)的吸光度確定DNA 濃度；相應(yīng)于1μg/mLdsDNA 溶液A260=0.02。標(biāo)準(zhǔn)液常用小牛胸腺DNA制備，PikoGreen 試劑測(cè)定法在通常污染*的幾種復(fù)合物存在的條件下仍能保持線(xiàn)性良好，但是，為了得到有效的對(duì)照處理，被用來(lái)做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的dsDNA 溶液要用和實(shí)驗(yàn)樣品相同的方式來(lái)處理，并且應(yīng)該包含相同的可能存在的污染物。
2) 制備從0.5ng/mL 到500ng/mL（見(jiàn)表1）單重復(fù)8 個(gè)點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，放入1 x 1cm 比色杯中?；旌舷嗤w積的1 x TE 和PikoGreen 操作溶液作為空白對(duì)照,避光于室溫下放置2-5 分鐘。
表1: 用1 x 1cm 比色杯時(shí)DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃度配制參考
標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL) |
1000 | 1 | 1 | 500 |
200 | 1 | 1 | 100 |
50 | 1 | 1 | 25 |
20 | 1 | 1 | 10 |
5 | 1 | 1 | 2.5 |
2 | 1 | 1 | 1 |
1 | 1 | 1 | 0.5 |
0 | 1 | 1 | 空白 |
3) 當(dāng)用微量檢測(cè)皿適配器時(shí)，PikoGreen 測(cè)定也可在較低的測(cè)定體積（50μL 到200μL）內(nèi)完成。產(chǎn)生從1ng/mL 到100ng/mL（見(jiàn)表2）的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，配制一系列的標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液，然后與等體積的PikoGreen 工作液混和，將至少50μL 溶液轉(zhuǎn)移到微量檢測(cè)皿中。確信不要在樣品中引入氣泡，輕輕地彈微量檢測(cè)皿的外部經(jīng)?？梢则?qū)散氣泡。避光于室溫下放置2-5 分鐘。
表2：用微量檢測(cè)皿DNA 標(biāo)準(zhǔn)濃配制參考
標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液濃度（ng/mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 溶液體積（mL） | PikoGreen 工作液體積（mL） | 標(biāo)準(zhǔn)DNA 終濃度(ng/mL) |
200 | 30 | 30 | 100 |
50 | 30 | 30 | 25 |
20 | 30 | 30 | 10 |
5 | 30 | 30 | 2.5 |
2 | 30 | 30 | 1 |
0 | 30 | 30 | 空白 |
4) 孵育后用合適的熒光計(jì)測(cè)量樣品熒光值。Ex/Em=480nm/520nm，為了減少光漂白，應(yīng)保持所有樣品的檢測(cè)時(shí)間*。用熒光值z(mì)ui大的樣品校正儀器。
5) 用檢測(cè)數(shù)據(jù)與DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度做回歸分析，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
3. 樣品分析
1) 用1 x TE 稀釋待測(cè)DNA 樣品至需要的體積（1x1cm 比色杯需1.0mL，微量檢測(cè)皿需25-100μL）。對(duì)樣品高度稀釋可以確保任何污染物都被zui大限度地沖淡。然而，也要避免取樣體積太小而無(wú)法精確吸取的情況。
2) 在每個(gè)樣品中加入等體積PikoGreen 工作液，混合好，將混合物移入合適的比色杯，避光于室溫下放置2-5 分鐘。
3) 檢測(cè)、讀取熒光值，換算樣品中dsDNA濃度?？梢詫?duì)樣品進(jìn)行不同的稀釋處理重復(fù)測(cè)定以確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。
PikoGreen dsDNA quantitation reagent運(yùn)輸和保存方法
常溫運(yùn)輸。4℃避光干燥保存，有效期6個(gè)月。
PikoGreen dsDNA quantitation reagent注意事項(xiàng)
1) PikoGreen定量試劑含有DMSO，PikoGreen 是結(jié)合dsDNA，操作時(shí)采取適當(dāng)防護(hù)，戴手套小心操作；
2) 盡管常見(jiàn)污染物不會(huì)影響PikoGreen 檢測(cè)dsDNA濃度（見(jiàn)PikoGreen耐受污染物列表），但是當(dāng)樣品中dsDNA濃度太低，RNA, ssDNA濃度超過(guò)dsDNA 10倍以上時(shí)，RNA, ssDNA等污染還是會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生較大干擾，在此種情況下，RNA 酶可以消除RNA干擾, RNA 酶A、酶T1 、核酸酶S1 結(jié)合能除去ssDNA干擾，從而保證樣品熒光值是由dsDNA 產(chǎn)生。
