110028人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）定量檢測試劑盒（ELISA）：英文名稱：Human Vascular endothelial growth factor（VEGF） ELISA KIT。本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。僅供科研使用，定量檢測血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的濃度。

僅供科研使用，不得用于臨床檢驗。

人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）定量檢測試劑盒（ELISA）說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）定量檢測試劑盒（ELISA）

英文名稱：Human Vascular endothelial growth factor（VEGF） ELISA KIT

【包裝規(guī)格】

48人份/盒，96人份/盒

【預(yù)期用途】

僅供科研使用，定量檢測血清、血漿、細(xì)胞培養(yǎng)上清液中人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的濃度。

【檢驗原理】

人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）定量檢測試劑盒（ELISA）采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。在預(yù)包被抗人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）抗體（固相抗體）的微孔酶標(biāo)板中，加入人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）校準(zhǔn)品和待測樣本，再加入另一株HRP標(biāo)記的抗人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）抗體（酶標(biāo)抗體），經(jīng)過溫育與充分洗滌，去除未結(jié)合的組分，在微孔板固相表面形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體的夾心復(fù)合物。加底物A和B，底物在HRP催化下，產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物，在終止液（2M 硫酸）作用下，zui終轉(zhuǎn)化為黃色，在酶標(biāo)儀上測定吸光度（OD值），吸光度（OD值）與待測樣品中人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的濃度正相關(guān)。擬合校準(zhǔn)品曲線，可以計算出樣本中人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF）的濃度。

【主要組成成分】

主要成分

校準(zhǔn)品濃度依次為：1000、500、250、125、62.5、0 pg/ml。校準(zhǔn)品已經(jīng)通過測試，結(jié)果表明HBs抗原陰性，HIV1、HIV2和HCV抗體陰性，由于不存在一種試驗方法能夠*保證沒有這些物質(zhì)，本品必須按照具有潛在的感染性進(jìn)行處理，處理過程應(yīng)當(dāng)遵循通用的安全措施。

需要但未提供的材料及耗材

  1、酶標(biāo)儀

2、精密移液器及一次性吸頭

3、蒸餾水

4、洗瓶或者自動洗板機

5、37℃水浴鍋或恒溫箱

6、500ml量筒

7、無粉一次性乳膠手套

8、質(zhì)控品（可從藍(lán)圖生物科技產(chǎn)品研發(fā)系統(tǒng)中選擇）

【儲存條件及有效期】

  1、2-8℃保存，切勿冷凍，有效期6個月。

  2、開封使用后，包被微孔板放入帶有干燥劑的自封袋中，密閉自封袋，并將全部試劑放回2-8℃冰箱。

  3、開封后，按照建議的條件保存，校準(zhǔn)品、包被微孔板和HRP標(biāo)記抗體，有效期為14天，其他成分在標(biāo)簽標(biāo)明的有效期內(nèi)是穩(wěn)定的。

【適用儀器】

  半自動的酶標(biāo)儀，如Thermo MK3，或者國產(chǎn)酶標(biāo)儀。

【樣本要求】

  樣本類型和采集

以下只是列出樣品采集的一般指南。所有樣本采集過程中，不得使用疊氮鈉做為防腐劑。

1、細(xì)胞培養(yǎng)上清：4000rpm條件下離心20min，去除細(xì)胞顆粒和聚合物，上清液保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。

2、血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，4000rpm條件下離心20min，小心地分離出血清，保存在- 20℃以下，避免反復(fù)凍融。

3、血漿：肝素，EDTA，或檸檬酸鈉作為抗凝劑。在4000rpm條件下，離心20分鐘取上清，血漿保存在-20℃以下，避免反復(fù)凍融。

樣本保存和穩(wěn)定性

樣本在2-8℃條件下，可以儲存72h，或者在- 20℃儲存6個月。樣本收集后，不是一次檢測完，請按一次用量分裝凍存，避免反復(fù)凍融，使用時在室溫下解凍，確保樣品均勻充分解凍。

【檢驗方法】

試劑準(zhǔn)備

1、使用前，所有的組分都要至少復(fù)溫30min，確保充分復(fù)溫到室溫。

2、濃縮洗滌液：從冰箱取出的濃縮洗滌液，會有結(jié)晶產(chǎn)生，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解。濃縮洗滌液與蒸餾水，按1:20稀釋，即1份的濃縮洗滌液，添加19份的蒸餾水。

3、底物：底物液A和B，在使用前，按1:1體積充分混合，混合后15分鐘內(nèi)使用。

操作程序

1、所有試劑和組分都先恢復(fù)到室溫，標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控品和樣品，建議做復(fù)孔。

2、按前面試劑準(zhǔn)備中描述的方法，配制好試劑盒各種組分的工作液。

3、從鋁箔袋中取出所需板條，剩余的板條用自封袋密封放回冰箱。

4、設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL，樣本孔加待測樣本50μL，空白孔不加。

5、除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體100μL。

6、用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

7、揭開封板膜，棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置20s，甩去洗滌液，吸水紙上拍干。

8、如此重復(fù)4次（共洗板5次）。若使用自動洗板機，請按洗板機操作程序進(jìn)行洗板，添加浸泡20s的程序，可以提高檢測的精度。洗板結(jié)束，加底物前，要在干凈不掉屑的紙上，充分拍干反應(yīng)板。

9、將底物A和B按1:1體積充分混合，所有孔中加入底物混合液100μL。用封板膜蓋住反應(yīng)板，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育15min。

10、所有孔加入終止液50μL，在酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值）。

【檢驗結(jié)果的解釋】

檢測完成后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度做為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的吸光度（OD值）作為橫坐標(biāo)，利用計算機軟件，采用四參數(shù)Logistic曲線擬合（4-pl），創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，通過樣本的吸光度（OD值），利用方程計算樣品的濃度值。

如果樣品被稀釋，通過上述方法測的的濃度值，要乘以稀釋倍數(shù)，才是樣品的zui終濃度。

【檢驗方法的局限性】

1、僅供科研使用，不得用于臨床診斷。

2、在試劑盒標(biāo)示的有效期內(nèi)使用，過期產(chǎn)品不得使用。

3、跟其他廠家的試劑盒或者組分不能混用。

4、使用試劑盒配套的樣品稀釋液。

5、如果樣本值高于zui高標(biāo)準(zhǔn)品濃度值，請將樣本適當(dāng)稀釋后，再重新測定。

6、待測樣本中存在的人抗鼠等異嗜抗體會干擾檢測結(jié)果，檢測前，請排除該因素。

7、通過其他方法得到的檢測結(jié)果，與本試劑盒測定結(jié)果不具有直接的可比性。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】

1、物理性能

試劑盒的各液體組分應(yīng)澄清透明、無沉淀或者絮狀物。微孔板鋁箔袋應(yīng)真空包裝，無破損漏氣。

2、劑量反應(yīng)曲線線性

校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.9900。

3、精密度

批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。批內(nèi)變異系數(shù)CV%小于10%。

批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。批間變異系數(shù)CV%小于15%。

4、靈敏度

zui低檢出劑量小于5 pg/ml。

5、回收率

三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行五次回收率評估，回收率在85%-115%之間。

6、特異性

本試劑盒識別天然和重組人表皮細(xì)胞生長因子（VEGF），與結(jié)構(gòu)類似物無交叉。

7、穩(wěn)定性

    2℃-8℃保存，有效期6個月。

【注意事項】

生物安全

1、檢測必須符合實驗室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染，所有樣品、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置。

2、試劑盒的液體組分中，含有proclin-300防腐劑，可能引起皮膚過敏反應(yīng)，避免吸入煙霧與皮膚接觸。

3、底物液對皮膚、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入煙霧。戴上防護手套，實驗完成后*洗手。

技術(shù)提示

1、混合蛋白溶液時，避免起泡。

2、加校準(zhǔn)品與樣本時，每個校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭，公共組分應(yīng)該懸臂加樣，避免交叉污染。

3、合適的溫育時間，和充分的洗滌步驟，是保證實驗結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件。

4、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{(lán)色，代表底物溶液已經(jīng)失效，不得使用。

5、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序*，加入終止液后，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會瞬間變?yōu)辄S色。

6、實驗中，用剩的板條，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。

7、所有液體組分，使用前充分搖勻，嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作。

廢物處理

  所有使用或未使用的試劑，所有污染性的一次性材料，應(yīng)當(dāng)遵循傳染性或潛在傳染性產(chǎn)品的處理程序，每個實驗室都有責(zé)任根據(jù)其實驗的類型和危險性級別，進(jìn)行廢物和污物的處理，同時要嚴(yán)格依照有關(guān)規(guī)定對待所有的廢物和污物。