由于細(xì)胞的高度透明性，觀察其中的細(xì)胞器十分困難。通過(guò)熒光染色，生物學(xué)家可以標(biāo)記特定的細(xì)胞器對(duì)其進(jìn)行觀察。絕大部分熒光分子在吸收或發(fā)射過(guò)程中，表現(xiàn)為有方向的偶極子。通過(guò)熒光偏振顯微鏡測(cè)量偶極子特性，能夠反映靶分子的取向特性，從而為研究靶分子的空間構(gòu)象和運(yùn)動(dòng)特性提供重要信息。
 

　　為了打破傳統(tǒng)熒光偏振顯微鏡受光學(xué)衍射限制的問(wèn)題，諸多超分辨熒光偏振顯微鏡技術(shù)被提出，如單分子定向定位顯微鏡(SMOLM)和偏振調(diào)制技術(shù)(SDOM、SPoD等)。然而，SMOLM在追求高空間分辨率的同時(shí)犧牲了時(shí)間分辨率，使得快速生物成像成為一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。SDOM等偏振調(diào)制技術(shù)雖具有較高的時(shí)空分辨率，但只能求解偶極子的二維取向，缺乏解析偶極子三維取向的能力。三維取向能夠提供熒光分子更全面的三維空間結(jié)構(gòu)，因此，關(guān)鍵問(wèn)題是如何打破時(shí)空分辨率和取向維度之間的權(quán)衡，實(shí)現(xiàn)超過(guò)衍射極限分辨率的同時(shí)，能夠快速成像和解析偶極子的三維方向。
 

　　針對(duì)偶極子取向解析問(wèn)題，北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院席鵬教授團(tuán)隊(duì)繼2016年提出二維偶極子取向映射方法SDOM(Light.: Sci. Appl., 2016)，及2022年基于光學(xué)鎖相探測(cè)的二維取向映射方法OLID-SDOM(Light.: Sci. Appl., 2022)后，為打破時(shí)空分辨率和三維取向維度的權(quán)衡瓶頸，開(kāi)發(fā)了新型的三維取向映射顯微鏡(3DOM)。相關(guān)研究成果以“Three-dimensional dipole orientation mapping with high temporal-spatial resolution”為題，于2024年4月16日在線發(fā)表在PhotoniX期刊。
 

　　3DOM方法基于團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)的偏振結(jié)構(gòu)光超分辨顯微技術(shù)，把楊氏雙縫干涉的原理反過(guò)來(lái)，結(jié)合光路可逆的原理，利用不同角度的條紋產(chǎn)生不同方向的正負(fù)一級(jí)光束。進(jìn)一步，只需要把相應(yīng)的負(fù)一級(jí)次光擋住，就可以產(chǎn)生單一方向的傾斜照明。把這一傾斜投影到z軸不同的角度，利用FISTA算法對(duì)圖像進(jìn)行重建，在倒易空間結(jié)合偏振調(diào)制系數(shù)和重建結(jié)果，即可實(shí)現(xiàn)高精度的偶極子取向解析。
 

圖1 三維取向映射顯微鏡原理圖
 

圖2 SYTOX Orange標(biāo)記λ-DNA的3DOM成像結(jié)果
 

　　研究結(jié)果表明，3DOM方法有效地克服了偏振熒光顯微鏡在使用寬場(chǎng)成像進(jìn)行高時(shí)空分辨率和三維方向映射方面的局限性，提供了更全面的熒光團(tuán)分子的三維空間結(jié)構(gòu)。這不僅能夠應(yīng)用于區(qū)分DNA、膜細(xì)胞器以及各種細(xì)胞骨架組織的宏觀形態(tài)(肌動(dòng)蛋白絲和微管)，而且還可以獲得結(jié)構(gòu)的有序性和結(jié)合緊密度等有價(jià)值的信息。此外，3DOM的主要優(yōu)點(diǎn)之一是它易于在現(xiàn)有的寬場(chǎng)系統(tǒng)中升級(jí)，適用范圍廣，這增強(qiáng)了其在不同研究環(huán)境中的可及性和可用性?？梢灶A(yù)見(jiàn)未來(lái)3DOM這個(gè)強(qiáng)大的工具將會(huì)有助于研究人員解析復(fù)雜的細(xì)胞器結(jié)構(gòu)，推動(dòng)對(duì)眾多生物結(jié)構(gòu)和納米級(jí)相互作用的理解，為結(jié)構(gòu)生物學(xué)家、生物動(dòng)力學(xué)家?guī)?lái)新的觀察工具。
 

　　席鵬和生命科學(xué)學(xué)院李美琪老師為本文的共同通訊作者。北京大學(xué)未來(lái)技術(shù)學(xué)院博士生鐘素藝為該項(xiàng)成果的第一作者。該研究得到了科技部國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、國(guó)家自然科學(xué)基金等項(xiàng)目的支持。
 

　　席鵬課題組致力于發(fā)展新型超分辨顯微成像技術(shù)，在偏振超分辨方面開(kāi)展了如下工作：(1)利用偏振偶極子解析實(shí)現(xiàn)了50nm的超分辨與熒光二維偶極子測(cè)量(Light: Science and Applications 2016 ); (2)通過(guò)解析結(jié)構(gòu)光超分辨中的偏振信息，實(shí)現(xiàn)了偏振SIM超分辨(Nature Communications 2019)，并成功實(shí)現(xiàn)商業(yè)化；(3)結(jié)合熒光分子的化學(xué)極性(光譜紅移)與物理序性(偶極子自由度)信息，成功實(shí)現(xiàn)了10種細(xì)胞器的同時(shí)觀察與環(huán)境研究(Nature Communications 2020)；(4)通過(guò)偏振調(diào)制和光學(xué)鎖定放大技術(shù)來(lái)增強(qiáng)微弱的偏振調(diào)制信號(hào)，實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光各向異性的高靈敏度測(cè)量(Light: Science and Applications 2022)；(5)發(fā)展了具有偶極子方位解析能力的3D-SIM開(kāi)源軟件Open-3DSIM(Nature Methods 2023 )和開(kāi)源硬件(Advanced Photonics Nexus 2024)；(6)對(duì)相關(guān)的SIM重建算法進(jìn)行了系統(tǒng)綜述(Light: Science and Applications 2023) 。