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摘要:植物組織中是否有花色苷及其類型 ,可通過(guò)植物組織的顏色、 抽提液的顏色、 抽提液在 pH梯度中的顏色，根據(jù)的研究方法等作大致的推斷 ,但對(duì)植物組織中的花色苷進(jìn)行較的定性還需做進(jìn)一步分離、 純化和鑒定.定量分析要依據(jù)材料不同而選擇不同的方法 ,本文對(duì)花色普定性定量研究方法進(jìn)行了綜述.
花色苷是一種黃酮類色素 ,存在于大部分的花和果實(shí)中 ,一些植物的莖和葉中也存在花色苷.花色苷作
為一種天然食用色素 ,安全、 無(wú)毒、 且具有一定的營(yíng)養(yǎng)和藥理作用 ,在一些功能性食品和化妝品中已有應(yīng)用,
因此越來(lái)越受到人們的重視[ 1, 2 ]
.花色苷是由花色素和糖結(jié)合形成的配糖體 ,常見(jiàn)的花色素主要有 6種 ,分
別是天葵色素 (花葵素 )、 矢車菊素、 飛燕草色素 (翠雀素 )、 芍藥色素、 牽牛花色素和錦葵色素 (二甲花翠
素 )
[ 3 ]
.花色苷的種類決定于花色素的種類、 糖基的種類以及花色素與糖基的結(jié)合部位.本文對(duì)花色苷定性
定量的方法進(jìn)行了概述 ,以方便對(duì)植物的花色苷進(jìn)行較為廣泛和深入的研究 ,從而為進(jìn)一步研究花色苷的性
質(zhì)奠定基礎(chǔ).
1　 花色苷的簡(jiǎn)單定性
可根據(jù)植物體的顏色判斷.當(dāng)植物組織呈現(xiàn)有藍(lán)色或紫色時(shí) ,其肯定含有花色素;呈紅色時(shí),則可能含有
花色素也可能含有類胡蘿卜素 ,這時(shí)可根據(jù)水溶性來(lái)區(qū)別 ,花色素類較易溶于水而類胡蘿卜素不易溶于
水[ 2 ]
.若將含有花色素的植物體的切片暴露于醋酸蒸汽中會(huì)變成紅色 ,而暴露于氨蒸汽中時(shí) ,會(huì)依紫— 藍(lán) —
綠的順序發(fā)生顏色變化[ 2 ]
.花色苷的顏色會(huì)隨溶液 pH的變化而變化 ,花色苷在強(qiáng)酸性溶液中呈穩(wěn)定的紅
色 ,弱酸性至中性溶液中呈紅紫色 ,堿性溶液中呈藍(lán)色.主要含有天竺葵色素、 矢車菊素的糖苷提取物會(huì)呈現(xiàn)
橙到紅色 ,含有甲基花青素糖苷的為深紅 ,含有飛燕草素、 矮牽牛苷配基和錦葵色素糖苷的則會(huì)顯出紅色 ,而
糖苷基團(tuán)的?；赡軙?huì)有一種藍(lán)化效果[ 3 ]
.花色苷的酰基化會(huì)影響花色苷的穩(wěn)定性.非?；蛦熙；幕?br />色苷在 pH值很低時(shí) ,其溶液呈現(xiàn)zui強(qiáng)的紅色.隨著 pH值的增大 ,花色苷的顏色將褪至無(wú)色 ,zui后在高 pH值
時(shí)變成紫色或藍(lán)色.但是具有兩個(gè)或兩個(gè)以上酰基的花色苷在整個(gè) pH值范圍內(nèi)都表現(xiàn)出相當(dāng)好的顏色穩(wěn)
定性[ 4 ]
.將植物組織用石油醚提取 ,若無(wú)色則說(shuō)明提取物不含類胡蘿卜素和葉綠素;向提取物中加入 10%
HCl若呈現(xiàn)各種紅色且加入 25%氨溶液后呈現(xiàn)各種黃綠 (花色苷的藍(lán)色與類黃酮的黃色產(chǎn)生 )則說(shuō)明含有
花色苷和類黃酮 (除去橙酮 )
　2　 花色苷的提取
花色苷提取方法的選擇取決于提取的目的和花色苷的種類.多用鹽酸甲醇溶液或蟻酸甲醇液提取[ 7 ]
.
定量提取需在低溫下保持一夜 ,若渾濁還需過(guò)濾或離心分離;若只用于層析的樣品 ,則提取 10 - 15 min即
可[ 8 ]
.當(dāng)提取的花色苷要用于食品著色時(shí) ,考慮到甲醇的毒性 ,應(yīng)選擇鹽酸乙醇溶液。
提取花色苷時(shí)用鹽酸酸化可以保持低 pH值,阻止無(wú)酰基的花色苷的降解,但隨著鹽酸甲醇液或蟻酸甲醇
液的蒸發(fā)鹽酸被濃縮其結(jié)果會(huì)導(dǎo)致花色苷的降解. Revilla等對(duì)紅葡萄中色素進(jìn)行提取的研究表明提取液中鹽
酸的濃度大于 0 . 12 mol /L就會(huì)引起含?；幕ㄉ盏牟糠炙鈁 9 ]
.因此為了獲得更接近于天然狀態(tài)的花色苷,
可采用中性溶劑或弱有機(jī)酸做初步提取.如果既要考慮色素的產(chǎn)量,又要盡量保持色素的原始狀態(tài),可以選擇
有機(jī)酸和甲醇提取花色苷,其中,檸檬酸是的,其次是酒石酸、 甲酸、 乙酸和丙酸.一些學(xué)者采用丙酮作提取
劑,其效果比酸化的甲醇液要好,且操作可在相對(duì)較低的溫度下進(jìn)行[ 7 ]
.初步提取的花色苷提取物通常很稀,一
般用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮.因花色素類不耐高溫,所以濃縮時(shí)溫度不要超過(guò) 40℃,時(shí)間也不宜太久.
3　 花色苷的分離純化
3 . 1　 紙層析
是分離天然色素的一種較為傳統(tǒng)的方法 ,具有快速、 設(shè)備簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn) ,但此法分離到的花色苷的量很有
限.常用新華 NO. 3或 What manNO. 3層析紙 ,多以 BAW (正丁醇 -醋酸 -水 = 4∶ 1∶ 2 v/v)、 MAW (正丁醇 -
醋酸 -水 = 4∶ 1∶ 5v/v)為展液.大規(guī)模分離 (1 - 100mg)時(shí)常用 BH (正丁醇 - 2mol /L鹽酸 = 1∶ 1上層 v/v)和
15%的乙酸為展液.展開后 ,用酸性甲醇或乙醇洗滌 ,*反復(fù)沉淀、 濃縮 ,即可得到樣品[ 2, 8 ]
.
3 . 2　 薄層層析
可用硅膠作吸附劑 , Harbon的研究表明以乙酸乙酯 -甲酸 - 2mol /L鹽酸 ( 86∶ 5∶ 9)為展液尤適用于分
離用紙層析很難分離的錦葵色素和芍藥色素[ 8, 10 ]
.也可用纖維素作吸附劑.具有速度快、 分辨力好的優(yōu)點(diǎn) ,但
同紙層析法一樣 ,此法分離到的花色苷的量也很有限.
3 . 3　 柱層析
是日前普遍采用的純化花色苷的方法 ,對(duì)于不揮發(fā)的花色苷的分離是理想的;多以吸附樹脂、 凝膠為吸
附劑.在游離花色素的情況下 ,洗脫速度取決于游離酚羥基對(duì)氫鍵的利用程度 ,依次為:錦葵素 >芍藥素 >天
竺葵素 >碧冬茄素 >矢車菊素 >飛燕草素。
3 . 4　HPLC (液相色譜 )
可用制備型 HPLC (p reparative HPLC)來(lái)純化花色苷. Fi orini用 Sphefis orb ODS - 2柱對(duì)草莓、 接骨木、 茄
子、 蘿卜等的花色苷進(jìn)行了提取 ,結(jié)果表明 HPLC是分離單糖基或酰化的二糖基和三糖基花色苷的一種有效
的方法[ 11 ]
. 近來(lái) ,科學(xué)工作者多用快速、 樣品用量極少、 溶劑消耗極少的毛細(xì)管電泳 (CE) , 1997年
B ridle用毛細(xì)管區(qū)帶電泳 (CZE)使得混有草莓和接骨木漿果花色苷獲得了分離. 1998年 Watanabe用膠束電
動(dòng)毛細(xì)管色譜法 (MEKC /MECC)分析了糖果、 果汁、 果凍等食品中的接骨木色素 ,不到 10 min所有的花色苷
都得到分離[ 12 ]
.
4　 花色苷的定性分析
4 . 1　 紙層析與薄層層析
常用的展開劑有 BAW (正丁醇 -乙酸 -水 = 4∶ 1∶ 5v/v/v)、 BH (正丁醇 - 2mol /L鹽酸 = 1∶ 1)、 1%鹽酸
(濃鹽酸 -水 = 3∶ 97)等.可通過(guò)各種花色苷在紙層析與薄層層析中的 Rf值來(lái)推斷花色苷的種類.各種花色
苷的 Rf值可參考文獻(xiàn)[ 2, 6, 13 ]
等得到.紙層析與薄層層析用于花色苷的定性分析很有限且缺乏性.
4 . 2　 紫外 -可見(jiàn)光譜法
通常用 0 . 01%的鹽酸甲醇液作為溶劑測(cè)定其紫外吸收值 (也可用 0 . 01%的鹽酸乙醇 ) .花色苷及其色
素元在可見(jiàn)光 465 - 550 nm,紫外光 275 nm處有吸收峰 ,不過(guò)通常提取物要在 200 - 700 nm范圍掃描 ,與酰
基化有關(guān)[ 3 ]
.在 0 . 01%的鹽酸乙醇測(cè)定的λ max要比在 0 . 01%的鹽酸甲醇中的λ max長(zhǎng) 10 nm,在 0 . 01%的
鹽酸甲醇中的λ max比在水中的λ max長(zhǎng) 15 nm.
用紫外 -可見(jiàn)光譜法測(cè)定花色苷其要點(diǎn)如下:
①B環(huán)有鄰位羥基的確定 　 將花色苷及其色素元在 200 - 700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描.再加入 AlCl 3 ,
若出現(xiàn)紅移說(shuō)明 B環(huán)有鄰位羥基 ,則可區(qū)分矢車菊素、 牽牛色素、 飛燕草素 (有鄰位羥基 )與天竺葵素、 芍藥
色素、 錦葵色素 (無(wú)鄰位羥基 )。
② 糖基位置的確定 　糖基化會(huì)導(dǎo)致可見(jiàn)光區(qū)紫移 , 3 - 羥基位的糖基化會(huì)導(dǎo)致zui大紫移 (約 10 - 15
nm) , 5 -糖基化會(huì)紫移約 7 nm. 3, 5 -糖基化的花色苷與只 3 -羥基位糖基化的同花色素的花色苷不易區(qū)
分 ,但 5 -羥基的糖基化與?；瘯?huì)在 400 - 570 nm處產(chǎn)生不同的吸收值. 5 -羥基的沒(méi)有糖基化 ,只是 3 -
羥基位的糖基化有一個(gè)肩峰 , 5 -羥基的糖基化會(huì)在這個(gè)區(qū)域產(chǎn)生一個(gè)平臺(tái).糖基位置的確定方法就是
測(cè)定 E440 nm /Emax
[ 13 ]
.
③ 酰基是否存在的確定 　 測(cè)定在 300 - 330 nm范圍內(nèi)有無(wú)吸收峰 ,若有則說(shuō)明有?；? pH > 0 . 4時(shí) ,復(fù)
合酰化的花色苷在 560 - 600 nm或 600 - 640 nm還顯示一個(gè)額外的吸收zui大峰[ 3 ]
.
④ 甲基化與羥基化 　 花色苷 3’ 和 5’ 位置的羥基的甲基化會(huì)導(dǎo)致微量的紫移 ,但 7 -羥基的甲基化會(huì)導(dǎo)
致 8—10 nm的紫移 (伴隨顏色變紅 ).分子內(nèi)羥基數(shù)目增多會(huì)導(dǎo)致紅移 (顏色變紫 ).
⑤ 其它 　 添加甲醇鈉 (NaOMe)若可見(jiàn)光區(qū)的zui大吸收波長(zhǎng)紅移 ,且吸光度值不隨時(shí)間下降 ,則說(shuō)明花
色苷 4’ 位有羥基 ,且 3位羥基上形成糖苷[ 10 ]
.若花色苷在紫外光下有熒光則說(shuō)明 5位有取代基[ 10 ]
.當(dāng)黃烊
陽(yáng)離子在 4位上有苯基或甲氧基時(shí) ,通入二氧化硫后不會(huì)褪色[ 10 ]
.
4 . 3　 (液相色譜 )
HPLC可用于花色苷的定性和定量測(cè)定 ,但由于商業(yè)上可提供的花色苷標(biāo)準(zhǔn)物有限 ,所以限制了 HPLC
在花色苷定性方面的應(yīng)用[ 11 ]
.再加上液相色譜儀本身存在的缺點(diǎn) ,所以通常采用液相色譜儀與質(zhì)
譜、 核磁共振儀等連用的方法.
4 . 4　 花色苷的水解
將花色苷水解后 ,分別測(cè)定它的色素元、 糖基和?；俳Y(jié)合花色苷測(cè)定的結(jié)果 ,同樣可推測(cè)花色苷的種
類.常用的方法為:在色素的甲醇溶液中按 1∶ 1加入加入 2mol /L鹽酸 ,水浴回流 ,再用戊醇提取色素元 ,以
N -甲基雙辛胺的氯仿溶液除去酸 ,濃縮干燥可得?；瘎悠?除去色素元和酰化劑的溶液以氯仿除去多余
的胺 ,濃縮經(jīng)過(guò)微孔過(guò)濾器 ,可用于分析。
5　 花色苷的定量測(cè)定
5 . 1　 應(yīng)用朗伯
C為色素的濃度; E為所測(cè)得的消光值; V為稀釋倍數(shù);M為標(biāo)準(zhǔn)色素的相對(duì)分子量;ε 0為標(biāo)準(zhǔn)色素的分
子消光系數(shù)[ 2 ]
.
該方法測(cè)定花色苷總量需要在一個(gè)恒定的 pH介質(zhì)中進(jìn)行.首先要在定性的基礎(chǔ)上確定花色苷的種類,
然后測(cè)定單個(gè)花色苷的zui大吸收波長(zhǎng)下的摩爾消光系數(shù)ε或比消光度 E.但單個(gè)花色苷的差別很小,而且單
個(gè)花色苷組成的比率未知,所以一般用平均比消光度 av E來(lái)測(cè)定花色苷總量,誤差小于 0 . 2%.單個(gè)花色苷
的比消光度 E是很難得到的,可以利用參考文獻(xiàn)提供的數(shù)據(jù). Fuleki和 Francis利用該方法對(duì)紅莓子中花色
苷總量進(jìn)行了測(cè)定[ 1 ]
.陳炳華、 陳前火等用改進(jìn)的 Fuleki法測(cè)定了果實(shí)中花色苷的含量。
5 . 2　 經(jīng)過(guò)加工或儲(chǔ)藏的材料中花色苷總量測(cè)定的兩種方法
經(jīng)過(guò)加工或儲(chǔ)藏的材料會(huì)產(chǎn)生褐色降解物 ,這些降解物和花色苷具有相同的能量吸收范圍.這類花色苷
總量的測(cè)定 ,通常有兩種方法.
5 . 2 . 1　
依據(jù)花色苷發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)隨 pH而轉(zhuǎn)換,而超干擾作用的褐色降解物的特性不隨 pH而變化,通過(guò)實(shí)驗(yàn)確
定兩個(gè)對(duì)花色苷吸光度差別zui大,但對(duì)花色苷穩(wěn)定的 pH值,根據(jù) Fuleki的公式可以計(jì)算出花色苷總量[ 1 ]
.
5 . 2 . 2　 差減法
先測(cè)定樣品在可見(jiàn)光區(qū)zui大吸光度 ,經(jīng)二氧化硫或亞*鹽漂白或過(guò)氧化氫氧化后 ,再測(cè)定一次吸光
度 ,二者的差值就是花色苷的吸光度.參考用標(biāo)準(zhǔn)花色苷繪制的工作曲線 ,將吸光度換算成濃度.差減法使用
漂白劑因而能降低某些干擾組分的吸光度而使總花色苷濃度偏高。
5 . 3　 單個(gè)花色苷的定量分析
對(duì)于單個(gè)花色苷的定量分析 ,其分離純化是關(guān)鍵.早期單個(gè)花色苷純化的方法有乙酸鉛法、 聚酰胺法和離子交換樹脂法等 ,其中以離子交換樹脂法*. Amberlite CG - 50離子交換樹脂比較常
用.日前 , HPLC方法廣泛地應(yīng)用于總花色苷和單個(gè)花色苷的定量分析.
6　 結(jié)束語(yǔ)
近年來(lái) ,隨著人們對(duì)人工合成色素毒性及花色苷抗氧化性和生理功能的認(rèn)識(shí) ,對(duì)天然色素的需求量將會(huì)
越來(lái)越大 ,因此找到一種花色苷含量較多且其穩(wěn)定性較好的植物、 進(jìn)一步改進(jìn)花色苷分離提純的方法使其應(yīng)
用于生產(chǎn)實(shí)踐將是花色苷研究的重要方向.