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凝膠色譜調料分析
點擊次數(shù)：1252 發(fā)布時間：2014-10-31
分離親水氣單胞菌外毒素的
功能高分子凝膠色譜填料
摘要 由丙烯 酰胺 和甲叉丙烯 酰胺 在水 油懸 液中共 聚得 到聚丙烯 酰胺凝膠 Z S P， 并用 I R、 溶
劑吸收 實驗等對合成 的 Z S P的結構進 行了確證 。以商 品葡聚糖凝 膠色譜 S e p h a d d e x — G1 0 0為對
照 ， 研究 了 ZS P 一 1 0對 中華鱉致 病的親水氣單 胞菌外毒素蛋 白的分 離性能 ， 結果 表明經(jīng) S e p h a d e x —
G1 0 0和 Z S P一 1 0提純的外毒素蛋白均保留了生物活 （ 毒） 性 ， 純度高 。 從 S DS — P AGE分析結果 ， 可以
認為經(jīng)提純的毒素蛋 白是分 子量 為 3 2 KDa的純品。與 S e p h a d e x — G1 0 0凝膠相 比， 聚丙 烯酰胺凝膠
色譜填料 Z S P一 1 0對 蛋 白質 的回收率更 高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好 的應 用前景 的蛋 白
質分離色譜填料。
關鍵詞 ： 親水氣 單胞菌外毒素 聚丙烯酰胺凝膠
1 前言
在生物技術制取蛋 白質 的多級純化過程
中， 液相色譜被為一個必須步驟 ， 這表明操
作條件溫和、 又具有分子水平分離能力的液相
色譜為開創(chuàng)現(xiàn)代生物大分子化學樹立了一個里
程碑。在液相色譜 中， 無論是哪一種層析方法 ，
分離介質 的性能都是分離效果 的首要決定 因
素。目前所使用的多糖類蛋白色譜分離存在的
普遍存在易染菌、 回收率低 、 成本高等問題 。開
發(fā)的蛋 白分離介質受到國內外學者的廣泛
關注。蛋白分離層析介質 的發(fā)展趨勢可以認為
是對以天然大分子為母體 的層析介質不斷地進
行合成工藝改進 ， 提高性能 ， 使老產(chǎn)品更新?lián)Q
代； 同時大力開發(fā)以合成高聚物為骨架 的具有
優(yōu)異性能的新一代產(chǎn)品。
親水氣單胞菌在 自然界尤其在水體環(huán)境中
分布甚廣， 屬弧菌科， 能引起人和動物的多種疾
病n ， 特別是水生動物暴發(fā)性傳染病 ， 此病在我
國東南各地廣泛流行 ， 尤 以水溫較高的夏秋季
為劇， 導致水生養(yǎng)殖魚類大量死亡， 給漁業(yè)生產(chǎn)
造成重大經(jīng)濟損失 矗 。
親水氣單胞菌在習慣上被認為是條件致病
菌 ， 隨著細菌本身的研究的深入 ， 這一認識正在
被修正 。已有報道該菌的 O抗原、 菌毛及一些
表 面的非特異性粘附因子與該菌的致病性有
關“ 。 然而， 更多的報道指出致病侏能產(chǎn)生細胞
外毒素 ， 而毒素與致病關系密切 ~ 7 。 但是關于
毒素的種類和性質諸說不一 ， 未有定論。 我們用
自制的凝膠色譜介質對 中華鱉致病的親水氣單
胞菌素進行了分離。
2 實驗部分
2 ． 1 菌種
親水氣單胞菌菌株從廣東省東莞市某養(yǎng)殖
場患病的中華鱉中分離鑒定， 取材選取瀕死新
2 ． 2 細菌培養(yǎng)
親水氣單胞菌菌株接種合成培養(yǎng)基 中， 搖
床培養(yǎng) 3 5 ℃， 1 0 0 r ／ mi n， 2 4 h。 培養(yǎng)物經(jīng) 4_ C， 1 O
0 0 0 r ／ mi n離心 3 0 mi n ， 取上清液。 將此上清液
對小 白鼠（ 體重 1 8 ~2 2 g ） 腹腔進行注射（ 劑量
為 0 ． 4 ml ／ 只） ， 確證其生物活性 。
2 ． 3 聚丙烯酰胺凝膠色譜填料 Z S P的合成
在 甲 苯 和 三 氯 甲烷 溶 劑 中加 入 少 量
Twe e n 一 8 0和 1 9 ／ 6 * ， 滴加丙烯酰胺和甲
又丙烯酰胺水溶液 ， 5 0 V水浴恒溫 ， 滴加完畢待
分散均勻后加入適量過硫酸銨， 待反應完成后 ，
撤去水浴 ， 體系 自然冷卻至室溫， 減壓抽濾 ， 真
空干燥 ， 篩選出 2 0 0 ~3 0 0目產(chǎn)物備用。
2 ． 4 紅外分析： 采用布魯克 EQUI NOX 5 5傅
里葉變換紅外光譜儀 ， 波數(shù)范 圍為 4 0 0 ~4 0 0 0
c m～， 樣品采用 KB r壓片法進行測試。
2 ． 5 溶劑吸收實驗
將干燥至恒重 的 0 ． 1 ～0 ． 2 g Z S P聚合物
凝膠置于一特制的底部帶有多孔玻璃砂板的試
管中， 在室溫下置于溶劑 （ 水） 中浸泡 2 4 h。試
管用橡膠蓋密封 ， 放到一離心管內， 用 2 0 0 0 ~4
0 0 0 r ／ mi n離心 1 5 mi n除去過量的溶劑 ， 將帶
有溶脹劑的樹脂的試管迅速轉移到密閉的燒瓶
中稱重。溶劑吸收量用 1 g干樹脂 吸收的溶劑
重 量來表 示 。
2 ． 6 毒素的提純
2 ． 6 ． 1 硫酸銨鹽析
用 Na OH調節(jié)細菌培養(yǎng)物上清液至 p H 6 ，
再加入硫酸銨至 7 O 的飽和度 ， 4 ℃靜置 4 h，
1 0 0 0 0 r ／ mi n， 4 ℃離心 3 0 mi n， 去上清液， 沉淀
溶于洗脫緩沖液 中， 對相同緩沖液透析過夜 ， 將
透析后的樣品用 P EG2 0 0 0 0進行濃縮 ， 即為粗
提毒素。
2 ． 6 ． 2 S e p h a d e x G一 1 O 0凝膠過濾
將粗提 毒素 于 4 ℃裝 S e p h a d e x G1 0 0柱
（ P h a ma c i a產(chǎn)品， 1 ． 6×5 0 c m， 平均液及洗脫液
均為 5 0 mmo l ／ L Tr i s — HC1 ， p H 7 ． 8 ） ， 流速為 1 2
ml ／ h， 每管收集 4 ml ， 用紫外檢測儀 2 8 0 n m進
行檢測， 合并生物活性部分 ， 凍干濃縮。
2 ． 6 ． 3 Z S P 一 1 0凝膠過濾
將 粗 提 毒 素 于 4 n C裝 交 聯(lián) 度 為 1 O 9 ／ 5 的
Z S P 一 1 0 柱 （ 自制 ， 1 ． 6 ×5 0 c m， 平衡液及洗脫液
均 為 0 ． 2 mo l ／ I Na Ac — HAc ， p H5 ． O ） ， 流速為
1 2 ml ／· h， 每管收集 4 ml ， 用紫外檢測以 2 8 0
n m進行檢測 ， 合并生物活性部分， 凍干濃縮 。
2 ． 7 SDS— PAGE
采 用 La e mml i 不 連續(xù) S DS — P AGE系統(tǒng) ，
按常規(guī)方法在小型蛋白電泳儀上進行 1 0 0 V恒
壓電泳約 3 h。 所用分離膠濃度為 1 2 9 ／ 6 ， 濃縮膠
濃度為 4 9 ／ 6 ， 用考馬斯蘭法染色。
2 ． 8 小 白鼠毒性試驗
小 白鼠體重 1 8 ～2 2 g， 每組 2只， 分別腹腔
注射 0 ． 4 ml 毒素樣品。
3 結果與討論
3 ． 1 I R分析
圖 1 聚丙烯酰胺凝膠填料的 I R譜圖
圖 1是 聚 丙烯 酰胺 凝 膠 滲 透色 譜填 料 而引起的。 3 1 8 8 c m 處的強峰是 N— H伸縮振動
Z S P 一 1 0的紅外譜圖。3 3 9 4 c m 處寬而強的峰是 吸收峰。 2 9 3 2 c m 和 2 7 8 1 c m 處的強峰是 CH
一
OH伸縮振動的譜帶 ， 由樣 品中殘留水分存在 基團中不對稱和對 稱 C— H伸縮振動峰。1 4 0 0 c m～， 1 3 0 0 c m～， l l 0 0 c m 和 1 0 0 0 c m。附 近的峰
是 C— N伸縮振動和一 NH變形振動引起的。6 2 7
c m 處的峰是 N— H面外變形吸收峰。
3 ． 2 Z S P樹脂的吸水率
圖 2是 Z S P樹脂吸水率一交聯(lián)度曲線。 很
明顯， 在交聯(lián)度為 5 ～2 0 的范圍內樹脂 的
吸水率與交聯(lián)度成正 比。 由此可推測， 在所合成
的聚合物中交聯(lián)點的分布是 比較均勻的。
O0 5 ．o o％ I o． 00 ％ l 5 ． O0 ％ 2 0． o（ 2 5 |t ） 儡
空娃度
圖 2 Z S P樹脂吸水率一 交聯(lián)度 曲線
3 ． 3 毒素的純化
粗提毒素經(jīng) S e p h a d e x- -Gl O 0凝膠色譜柱
純化后 回收率為 1 8 ． 8 3 ， 經(jīng)交聯(lián)度為 1 0 的
聚 丙 烯 酰 胺 Z S P 一 1 0柱 純 化 后 回 收 率 為
6 8 ． 0 5 ， 洗脫液蛋峰分別為圖 3和圖 4 。 毒素的 S e p h a d e x — G 1 0 0層析
3 ． 4 SDS— PAGE
經(jīng) S e p h a d e x—G 1 0 0和聚丙 烯酰胺 Z S P一
1 0柱純化后的毒素進行 S DS — P AGE， 考馬斯蘭
圖 5 S e p h a d e x純化 S DS — P AGE
行 M： 分子量標準 ， 行 A：
粗提毒素 ． 行 B： 提純毒素
1 0天左右即會滋生霉菌， 不能再重復使用。而
Z S P 一 1 0 在 同樣的條件下可保存半年。 提純毒素
經(jīng)濃縮后注射小 白鼠， 2 4 h后小 白鼠死 亡， 可
以認為兩種凝膠色譜柱均保留了外毒素蛋白質
的生物 活性 。
圖 6 ZS P 一 1 0純化 S DS — PAGE
行 M： 分子量標準， 行 A；
粗提毒素 ， 行 B ： 提純毒素
結論 1
由丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺在水油懸液中
共 聚得 到交 聯(lián)度 為 1 0 的 聚丙 烯 酰胺 凝膠 ‘
Z S P 一 1 0 。Z S P 一 1 0對使 中華鱉致病 的親水氣單
胞菌外毒素蛋 白的分離性能 良好 ， 保留了生物 ．
活（ 毒） 性， 純度 高。 從 S D S — P AG E分析結果 ， 可
以認為經(jīng)提純 的毒素蛋白是分子量為 3 2 KDa 5
的純品。與 S e p h a d e x — G1 0 0凝膠相比， 聚丙烯
酰胺凝膠色填料 Z S P一 1 0對蛋 白質 的回收率更 6
高， 且成本低廉 ， 不易染菌 ， 是具有 良好的應用
前景的蛋白質分離色譜填料。 7
群體反應性抗體（ P RA） 高的免疫吸附治療
于 穎 ， 孟 建中
濟南 *總醫(yī)院血液凈化 中心 ， 山東 濟南 2 5 0 0 3 1
摘 要 目的 ： 研究高群體反應性抗體 （ P RA） 的患者進行 腎移植， 術后常發(fā)生超急性 （ HAR）
或急性排斥 （ AR） 反應 ， 導致移植腎功能 喪失 。方 法； 1 8例 PRA高的患者行免疫吸附 （ 1 A） 治療
前血液透析 1 ～6年。8例第 2次腎移植 ， 3例第 3次腎移植 。P RA 2例>7 O ， 5例 >5 O ， 5例
>3 O ， 6例>2 O 。 采 用 日本 p l a s a u t o — l Q免疫吸附系統(tǒng)機進行 免疫 吸附治療 。 結果 ； 1 8例 P RA
高 的患者行 l A 治療 3 ～8次后 ， 復查 PRA． 9例為 0 ， 6例<5 ， 3例 <1 O ， 都 達到了治療效果 。
結論 ： P RA 的檢測對提 高腎移植 成功率和存活率具有實際意義 ． 移 植后未發(fā)生 HAR和 AR， 為
患者解決 了因 PRA 高而不能 腎移植 的難題 。
關鍵詞 ： 群體反應性抗體 免疫吸附治療 腎移植
腎移植是治療慢性腎功能不全終末期腎衰
的主要方法之一， 若移植后的腎功能恢復正常，
其發(fā)揮的作用遠大于任何類型的透析。腎移植
的優(yōu)勢還在于能使患者骨髓代謝恢復正常 ， 消
除貧血， 并能正常生活與工作。 而群體反應性抗
體（ P RA） 高的患者進行 腎移植， 術后常發(fā)生超
急性 （ HAR） 或急排 斥 （ AR） 反應， 導致移植 腎
功能喪失 ， 甚至危機患者生命 。為解決這一難
題， 我院 自2 0 0 1年 1月至今， 為 1 8例患者行免
疫吸附（ I A） 治療療效顯著 ， 現(xiàn)總結如下 。
1 資料與方法
1 ． 1 一般資料
我院 自2 0 0 1年 1月至今為 1 8例 PRA高
的患者行免疫吸附（ I A） 治療 ， 男性 1 1例， 女性
7例 ， 年齡 1 8 ～6 5歲。 9例原發(fā)病均為慢性腎小