分光光度計(jì)的應(yīng)用常識--諾頂儀器信息網(wǎng)

點(diǎn)擊次數(shù)：660 發(fā)布時(shí)間：2014-11-9

1、蛋白質(zhì)的直接定量（UV法）

　　這種方法是在280 nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。

　　蛋白質(zhì)測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì)，一般要消除320nm的“背景”信息，設(shè)定此功能“開”。與測試核酸類似，要求 A 280 的吸光值至少大于 0.1A，*的線性范圍在1.0-1.5之間。實(shí)驗(yàn)中選擇 Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí)，發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過 1%，表明結(jié)果非常穩(wěn)定。

　　漂移的原因是因?yàn)閃arburg公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數(shù)，只要吸光值有少許改變，濃度就會(huì)被放大，從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。

　　蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾;另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

　　比色法蛋白質(zhì)定量

　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸（如*，*）與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

　　比色方法一般有 BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

　　Lowry 法：以zui早期的 Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret相比，Lowry法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長;容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA，Tritonx-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。BCA（Bicinchoninine acidassay）法：這是一種較新的、更敏感的蛋白測試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生 Cu+，后者與 BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562 nm波長。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系*，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對于Lowry 法，操作簡單，敏感度高。但是與 Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

　　Bradford 法：這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595 nm。其zui大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry 和 BCA 兩種測試方法的2倍;操作更簡單，速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果;而且與一系列干擾 Lowry，BCA反應(yīng)的還原劑（如DTT，巰基乙醇）相容。但是對于去污劑依然是敏感的。zui主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。

　　某些初次接觸比色法測定的研究者可能為各種比色法測出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA測出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測試后的濃度也不一致。如用Lowry測試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA 作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34 mg / ml，以 a 球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度 2.64 mg/ml。因此，在選擇比色法之前，是參照要測試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測試時(shí)間，所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在此時(shí)間內(nèi)測試。時(shí)間過長，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。除此，反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色杯，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。

2、核酸的定量

　　核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率zui高的功能?？梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。核酸的zui高吸收峰的吸收波長260nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一，因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應(yīng)的系數(shù)。如：1OD的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經(jīng)過上述系數(shù)的換算，從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者zui頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。

　　事實(shí)上，的設(shè)計(jì)原理和工作原理，允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化，即儀器有一定的準(zhǔn)確度和度。如EppendorfBiophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%（1A）。這樣多次測試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng)，都是正常的。另外，還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值，離子濃度等：在測試時(shí)，離子濃度太高，也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移，因此建議使用pH值一定、離子濃度較低的緩沖液，如TE，可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素：由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒，尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測試效果。為了zui大程度減少顆粒對測試結(jié)果的影響，要求核酸吸光值至少大于0.1A，吸光值在0.1-1.。在此范圍內(nèi)，顆粒的干擾相對較小，結(jié)果穩(wěn)定。從而意味著樣品的濃度不能過低，或者過高（超過光度計(jì)的測試范圍）。zui后是操作因素，如混合要充分，否則吸光值太低，甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡，空白液無懸浮物，否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測試空白液和樣品，否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的zui小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。

　　除了核酸濃度，同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度，如 A 260 / A280的比值，用于評估樣品的純度，因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?280 nm。純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于 1.8 或者2.0，表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽，*等，較純凈的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A 320 一般是 0。

3、細(xì)菌細(xì)胞密度（OD 600）

　　實(shí)驗(yàn)室確定細(xì)菌生長密度和生長期，多根據(jù)經(jīng)驗(yàn)和目測推斷細(xì)菌的生長密度。在遇到要求較高的實(shí)驗(yàn)，需要采用分光光度計(jì)準(zhǔn)確測定細(xì)菌細(xì)胞密度。OD600是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長的標(biāo)準(zhǔn)方法。以未加菌液的培養(yǎng)液作為空白液，之后定量培養(yǎng)后的含菌培養(yǎng)液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，做出校正曲線。實(shí)驗(yàn)中偶爾會(huì)出現(xiàn)菌液的OD值出現(xiàn)負(fù)值，原因是采用了顯色的培養(yǎng)基，即細(xì)菌培養(yǎng)一段時(shí)間后，與培養(yǎng)基反應(yīng)，發(fā)生變色反應(yīng)。另外，需要注意的是，測試的樣品不能離心，保持細(xì)菌懸浮狀態(tài)。