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液相色譜分析理論
點擊次數(shù)：601 發(fā)布時間：2014-11-11
液相色譜法
液相色譜法
液相色譜法是用高壓*將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，經(jīng)進樣閥注入供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，在柱內(nèi)各成分被分離后，依次進入檢測器，色譜信號由記錄儀或積分儀記錄。
1.對儀器的一般要求
所用的儀器為液相色譜儀。色譜柱的填料和流動相的組分應按各品種項下的規(guī)定.常用的色譜柱填料有硅膠和化學鍵合硅膠。后者以十八烷基硅烷鍵合硅膠zui為常用,辛基鍵合硅膠次之,氰基或氨基鍵合硅膠也有使用；離子交換填料,用于離子交換色譜；凝膠或玻璃微球等，用于分子排阻色譜等。注樣量一般為數(shù)微升。除另有規(guī)定外，柱溫為室溫，檢測器為紫外吸收檢測器。 在用紫外吸收檢測器時,所用流動相應符合紫外分光光度法（附錄Ⅳ Ａ）項下對溶劑的要求。 正文中各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得任意改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變, 以適應具體品種并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于20分鐘內(nèi)記錄完畢。
2.系統(tǒng)適用性試驗
按各品種項下要求對儀器進行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品對儀器進行試驗和調(diào)整,應達到規(guī)定的要求；或規(guī)定分析狀態(tài)下色譜柱的zui小理論板數(shù)、分離度和拖尾因子.
（1） 色譜柱的理論板數(shù)（n） 在選定的條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分或內(nèi)標物質(zhì)峰的保留時間t<[R]>（以分鐘或長度計，下同，但應取相同單位）和半高峰寬（W<[h/2]> ）,按n＝5.54（t<[R]>／W<[h/2]>）<2>計算色譜柱的理論板數(shù)，如果測得理論板數(shù)低于各品種項下規(guī)定的zui小理論板數(shù)，應改變色譜柱的某些條件（如柱長、載體性能、色譜柱充填的優(yōu)劣等），使理論板數(shù)達到要求。 （2） 分離度 定量分析時，為便于準確測量，要求定量峰與其他峰或內(nèi)標峰之間有較好的分離度。分離度（R）的計算公式為： 2（t<[R2]>－t<[R1]>） R＝ ──W<[1]>＋W<[2]> 式中 t<[R2]>為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； t<[R1]>為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W<[1]>及W<[2]>為此相鄰兩峰的峰寬。 除另外有規(guī)定外，分離度應大于1.5。
（3） 拖尾因子 為保證測量精度，特別當采用峰高法測量時，應檢查待測峰的拖尾因子（T）是否符合各品種項下的規(guī)定,或不同濃度進樣的校正因子誤差是否符合要求。拖尾因子計算公式為： W<[0.05h]> T＝────── 2d<[1]> 式中 W<[0.05h]>為0.05峰高處的峰寬； d<[1]>為峰極大至峰前沿之間的距離。 除另有規(guī)定外，T應在0.95～1.05間。 也可按各品種校正因子測定項下，配制相當于80％、100％和120％的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標溶液，配成三種不同濃度的溶液，分別注樣3次,計算平均校正因子，其相對標準偏差應不大于2.0％。
3.測定法
定量測定時，可根據(jù)樣品的具體情況采用峰面積法或峰高法。但用歸一法或內(nèi)標法測定雜質(zhì)總量時，須采用峰面積法。
（1） 面積歸一化法 測定供試品（或經(jīng)衍生化處理的供試品）中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度采用不加校正因子的峰面積歸一法。計算各雜質(zhì)峰面積及其總和，并求出占總峰面積的百分率。但溶劑峰不計算在內(nèi)。色譜圖的記錄時間應根據(jù)各品種所含雜質(zhì)的保留時間決定，除另有規(guī)定外,可為該品種項下主成分保留時間的倍數(shù)。
（2） 主成分自身對照法 當雜質(zhì)峰面積與成分峰面積相差懸殊時，采用主成分自身對照法。在測定前，先按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品稀釋成一定濃度的溶液作為對照溶液，進樣，調(diào)節(jié)檢測器的靈敏度或進樣量，使對照溶液中的主成分色譜峰面積滿足準確測量要求。然后取供試品溶液，進樣，記錄時間，除另有規(guī)定外，應為主成分保留時間的倍數(shù)。根據(jù)測得的供試品溶液的各雜質(zhì)峰面積及其總和并和對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)限度。
（3） 內(nèi)標法測定供試品中雜質(zhì)的總量限度 采用不加校正因子的峰面積法。取供試品,按各品種項下規(guī)定的方法配制不含內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液,注入儀器,記錄色譜圖Ｉ;再配制含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，在同樣的條件下注樣，記錄色譜圖Ⅱ。記錄的時間除另有規(guī)定外，應為該品種項下規(guī)定的內(nèi)標峰保留時間的倍數(shù)，色譜圖上內(nèi)標峰高應為記錄儀滿標度的30％以上，否則應調(diào)整注樣量或檢測器靈敏度。 如果色譜圖Ⅰ中沒有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標峰保留時間相同的雜質(zhì)峰，則色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰面積之和應小于內(nèi)標物質(zhì)峰面積（溶劑峰不計在內(nèi)）。如果色譜圖Ⅰ中有與色譜圖Ⅱ上內(nèi)標物質(zhì)峰保留時間相同的雜質(zhì)峰，應將色譜圖Ⅱ上的內(nèi)標物質(zhì)峰面積減去色譜圖Ⅰ中此雜質(zhì)峰面積，即為內(nèi)標物質(zhì)峰的校正面積；色譜圖Ⅱ中各雜質(zhì)峰總面積加色譜圖Ⅰ中此雜峰面積，即為各雜質(zhì)峰的校正總面積，各雜質(zhì)峰的校正總面積應小于內(nèi)標物質(zhì)峰的校正面積。
（4） 內(nèi)標法加校正因子測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項下的規(guī)定,精密稱（量）取對照品和內(nèi)標物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各溶液，配成校正因子測定用的對照溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子： A<[s]>／m<[s]> 校正因子（f）＝─ A<[r]>／m<[r]> 式中 A<[s]>為內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高； A<[r]>為對照品的峰面積或峰高； m<[s]>為加入內(nèi)標物質(zhì)的量； m<[r]>為加入對照品的量。 再取各品種項下含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品（或其雜質(zhì)）峰和內(nèi)標物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量： A<[x]> 含量（m<[x]>）＝f×──A<[s]>／m<[s]> 式中 A<[x]>為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高； m<[x]>為供試品（或其雜質(zhì)）的量； f、A<[s]>和m<[s]>的意義同上。 當配制校正因子測定用的對照溶液和含有內(nèi)標物質(zhì)的供試品溶液使用同一份內(nèi)標物質(zhì)溶液時，則配制內(nèi)標物質(zhì)溶液不必精密稱（量）取。
（5） 外標法測定供試品中某個雜質(zhì)或主成分含量 按各品種項下的規(guī)定,精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和供試品待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量： A<[x]> 含量（m<[x]>）＝m<[r]>×── A<[r]> 式中各符號意義同上 由于微量注射器不易控制進樣量，當采用外標法測定供試品中某雜質(zhì)或主成分含量時，以定量環(huán)進樣為好。