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共聚焦顯微鏡原理

時間:2014/12/12閱讀:710
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       從一個點光源發(fā)射的探測光通過透鏡聚焦到被觀測物體上,如果物體恰在焦點上,那么反射光通過原透鏡應(yīng)當(dāng)匯聚回到光源,這就是所謂的共聚焦,簡稱共焦。共焦顯微鏡[Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM或LSCM)]在反射光的光路上加上了一塊半反半透鏡(Beam Splitter),將已經(jīng)通過透鏡的反射光折向其它方向,在其焦點上有一個帶有針孔(Pinhole)的擋板,小孔就位于焦點處,擋板后面是一個 光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)。可以想像,探測光焦點前后的反射光通過這一套共焦系統(tǒng),必不能聚焦到小孔上,會被擋板擋住。于是光度計測量的就是焦點處的反射光強度。其意義是:通過移動透鏡系統(tǒng)可以對一個半透明的物體進行三維掃描。共聚焦顯微鏡能提供無比的三維成像,以及對亞細胞結(jié)構(gòu)和動力學(xué)過程的測試。

    激光掃描共聚焦顯微鏡是二十世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一項具有劃時代的高科技產(chǎn)品,它是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置,利用計算機進行圖像處理,把光學(xué)成像的分辨率提高了30%--40%,使用紫外或可見光激發(fā)熒光探針,從而得到細胞或組織內(nèi)部微細結(jié)構(gòu)的熒光圖像,在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+ 、PH值,膜電位等生理信號及細胞形態(tài)的變化,成為形態(tài)學(xué),分子生物學(xué),神經(jīng)科學(xué),藥理學(xué),遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強有力的研究工具。激光共聚焦成像系統(tǒng)能夠用于觀察各種染色、非染色和熒光標(biāo)記的組織和細胞等,觀察研究組織切片,細胞活體的生長發(fā)育特征,研究測定細胞內(nèi)物質(zhì)運輸和能量轉(zhuǎn)換。能夠進行活體細胞中離子和PH值變化研究(RATIO),神經(jīng)遞質(zhì)研究,微分干涉及熒光的斷層掃描,多重?zé)晒獾臄鄬訏呙杓爸丿B,熒光光譜分析熒光各項指標(biāo)定量分析熒光樣品的時間延遲掃描及動態(tài)構(gòu)件組織與細胞的三維動態(tài)結(jié)構(gòu)構(gòu)件,熒光共振能量的轉(zhuǎn)移的分析,熒光原位雜交研究(FISH),細胞骨架研究,基因定位研究,原位實時PCR產(chǎn)物分析,熒光漂白恢復(fù)研究(FRAP),胞間通訊研究,蛋白質(zhì)間研究,膜電位與膜流動性等研究,完成圖像分析和三維重建等分析。

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