1.流動(dòng)相必須用HPLC級(jí)的試劑，使用前過(guò)濾除去其中的顆粒性雜質(zhì)和其他物質(zhì)[使用0.45um或更細(xì)的膜過(guò)濾] 
2.流動(dòng)相過(guò)濾后要用超聲波脫氣，脫氣后應(yīng)該恢復(fù)到室溫后使用
3.不能用純乙腈作為流動(dòng)相，這樣會(huì)使單向閥粘住而導(dǎo)致泵不進(jìn)液
4.使用緩沖溶液時(shí)，做完樣品后應(yīng)立即用去離子水沖洗管路及柱子一小時(shí)，然 后用甲醇[或甲醇水溶液]沖洗40分鐘以上，以充分洗去離子對(duì)于柱塞桿 外部，做完樣品后也必須用去離子水沖洗20ml以上

5.長(zhǎng)時(shí)間不用儀器，應(yīng)該將柱子取下用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應(yīng)該用有機(jī)相[如甲醇等]，因?yàn)榧兯组L(zhǎng)霉
6.每次做完樣品后應(yīng)該用溶解樣品的溶劑清洗進(jìn)樣器
7.C18柱不能進(jìn)蛋白樣品，血樣生物樣品
8.堵塞導(dǎo)致壓力太大，按預(yù)柱混合器中的過(guò)濾器管路過(guò)濾器單向閥檢查 并清洗清洗方法；以異丙醇作溶劑沖洗：放在異丙醇中間用超聲波清 洗；用10％稀硝酸清洗
9.氣泡會(huì)致使壓力不穩(wěn)，重現(xiàn)性差，所以在使用過(guò)程中要盡量避免產(chǎn)生氣泡
10.如果進(jìn)液管內(nèi)不進(jìn)液體時(shí)，要使用注射器吸液：通常在輸液前要進(jìn)行流動(dòng)相 的清洗
11.要注意柱子的PH值范圍，不得注射強(qiáng)酸強(qiáng)堿的樣品，特別是堿性樣品
12.更換流動(dòng)相時(shí)應(yīng)該先將吸濾頭部分放入燒杯中邊振動(dòng)邊靖洗，然后插入新的 流動(dòng)相中更換無(wú)互溶性的流動(dòng)相時(shí)要用異丙醇過(guò)渡一下

常見(jiàn)故障的斷定及解決
可能的原因及解決方法 
[一]保留時(shí)間變化 
1.柱溫變化 柱恒溫，必要時(shí)需配置恒溫箱
2.等度與梯度間未能充分平衡 至少用10倍柱體積的流動(dòng)相平衡柱
3.緩沖液容量不夠 用25mmol/L的緩沖液
4.柱污染 每天沖洗柱
5.柱內(nèi)條件變化 穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動(dòng)相
6.柱快達(dá)到壽命 采用保護(hù)柱
[二]保留時(shí)間縮短 
1.流速增加 檢查泵,重新設(shè)定流速
2.樣品超載 降低樣品量
3.鍵合相流失 流動(dòng)相PH值保持在3~7.5檢查柱的方向
4.流動(dòng)相組成變化 防止流動(dòng)相蒸發(fā)或沉淀
5.溫度增加 柱恒溫
[三]保留時(shí)間延長(zhǎng) 
1.流速下降 管路泄漏,更換泵密封圈,排除泵內(nèi)氣泡
2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化 用流動(dòng)相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱

3.鍵合相流失 同前[二]3
4.流動(dòng)相組成變化 同前[二]4
5.溫度降低 同前[二]5
[四] 出現(xiàn)肩峰或分* 
1.樣品體積過(guò)大 用流動(dòng)相配樣,總的樣品體積小于*峰的15%
2.樣品溶劑過(guò)強(qiáng) 采用較弱的樣品溶劑
3.柱塌陷或形成短路通道 更換,采用較弱腐蝕性條件
4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效 更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過(guò)濾器,過(guò)濾樣品
5.進(jìn)樣器損壞 更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子
[五]鬼峰
1.進(jìn)樣閥殘余峰 每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗
2.樣品中未知物 處理樣品
3.柱未平衡 重新平衡柱,用流動(dòng)相作樣品溶劑 [尤其是離子對(duì)色譜]

4.三fu乙酸[TFA]氧化[肽譜] 每天新配,用抗氧化劑
5.水污染[反相] 通過(guò)變化平衡時(shí)間檢查水質(zhì)量，用HPLC級(jí)的水
[六] 基線噪聲 
1.氣泡[尖銳峰] 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓
2.污染[隨機(jī)噪聲] 清洗柱,凈化樣品,用HPLC級(jí)試劑
3.檢測(cè)器燈連續(xù)噪聲 更換氘燈
4.電干擾[偶然噪聲] 采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來(lái)源[如水浴等]
5.檢測(cè)器中有氣泡 流動(dòng)相脫氣,加柱后背壓
[七]峰拖尾 
1.柱超載 降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相
2.峰干擾 清潔樣品,調(diào)整流動(dòng)相
3.硅羥基作用 加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動(dòng)相PH值,鈍化樣品

4.同前[四]4 同前[四]4
5.同前[四]3 5.同前[四]3
6.死體積或柱外體積過(guò)大 連接點(diǎn)降至zui低,對(duì)所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管
7.柱效下降 用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱
[八]峰展寬 
1.進(jìn)樣體積過(guò)大 同[四]1
2.在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展 進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散
3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢 設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)
4.檢測(cè)器時(shí)間常數(shù)過(guò)大 設(shè)定時(shí)間常數(shù)為感興趣*峰半寬的10%
5.流動(dòng)相粘度過(guò)高 增加柱溫,采用低粘度流動(dòng)相
6.檢測(cè)池體積過(guò)大 用小體積池,卸下熱交換器
7.保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 等度洗脫時(shí)增加溶劑含量也可用梯度洗脫
8.柱外體積過(guò)大 將連接管徑和連接管長(zhǎng)度降至zui小
9.樣品過(guò)載 進(jìn)小濃度小體積樣品

液相使用經(jīng)驗(yàn)談
色譜柱在使用前，進(jìn)行柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品流動(dòng)相柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行[出廠測(cè)試所使用的條件是*條件]，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性 

1樣品的前處理： 
a使用流動(dòng)相溶解樣品 
b使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì) 
c使用0.45µm的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì) 
2流動(dòng)相的配制： 是樣品組分在柱填料與流動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流 
動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： 
a流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中[或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中] 
b流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)[特殊情況除外] 
c流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命[可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度] 

d流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)如使用UV檢測(cè)器，使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制 
e流動(dòng)相沸點(diǎn)不要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行 
f在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用
2流動(dòng)相流速的選擇： 因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效對(duì)于一根特定的，要追求*柱效，使用*流速對(duì)內(nèi)徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml／min，對(duì)于內(nèi)徑為4.0mm柱，流速0.8ml／min為佳 當(dāng)選用*流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)可采用改變流動(dòng)相的洗滌強(qiáng)度的方法以縮短分析時(shí)間[如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量] 
注意： 
a．由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系[必須使用乙腈的場(chǎng)合除外] 
b．對(duì)于正相柱推薦使用沸程為30-60的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用用水使用超純水[電阻率大于18兆歐]，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果 
c．含水流動(dòng)相zui*在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜加入*，防止細(xì)菌生長(zhǎng) 
d．流動(dòng)相要求使用0.45 µm濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì) 

e．使用HPLC級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)的使用壽命，提高柱性能
的常用術(shù)語(yǔ)
1色譜曲線romatogram）：色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或流動(dòng)相流出體積的曲線圖，或者通色譜圖（ch過(guò)適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ^察到的紙色譜或薄層色譜斑點(diǎn)譜帶的分布圖
2（色譜）峰（chromatographic peak）：流出組分通過(guò)檢測(cè)器系統(tǒng)時(shí)所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)的微分曲線
3峰底（peak base）：峰的起點(diǎn)與終點(diǎn)之間的連接的直線
4峰高（h ，peak height）：色譜峰zui大值點(diǎn)到峰底的距離
5峰寬（W ，peak width）：在峰兩側(cè)拐點(diǎn)處所作切線與峰底相交兩點(diǎn)的距離
6半高峰寬（W h/2 ，peak withd at half height）：通過(guò)峰高的中點(diǎn)作平行于峰底的直線，此直 線 與峰兩側(cè)相交兩點(diǎn)之間的距離（圖1 中的HJ）
7峰面積（A ，peak area）：峰與峰底之間的面積（圖1中的CHEJDC）
8拖尾峰（tailing peak）：后沿較前沿平緩的不對(duì)稱的峰
9前伸峰（leading peak）：前沿較后沿平緩的不對(duì)稱的峰（又叫伸舌峰前延峰）

10假峰（ghost peak）：除組分正常產(chǎn)生的色譜峰外，由于儀器條件的變化等原因而在譜圖上出現(xiàn)的色譜峰，即并非由試樣所產(chǎn)生的峰這種色譜峰并不代表具體某一組分，容易給定性定量帶來(lái)誤差（又叫鬼峰）
11畸峰（distrorted peak）：形狀不對(duì)稱的色譜峰， 前伸峰拖尾峰都屬于這類 
12反峰（negative peak）：也稱倒峰負(fù)峰，即出峰的方向與通常的方向相反的色譜峰
柱的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)[推薦]
的正確使用和維護(hù)十分重要，稍有不慎就會(huì)降低柱效縮短使用壽命甚至損壞在色譜操作過(guò)程中，需要注意下列問(wèn)題，以維護(hù)色譜柱
避免壓力和溫度的急劇變化及任何機(jī)械震動(dòng)溫度的突然變化或者使從高處掉下都會(huì)影響柱內(nèi)的填充狀況；柱壓的突然升高或降低也會(huì)沖動(dòng)柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流速時(shí)應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時(shí)閥的轉(zhuǎn)動(dòng)不能過(guò)緩（如前所述）
.應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┑慕M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改變?yōu)槿渴撬粗嗳?/font>
一般說(shuō)來(lái)不能反沖，只有生產(chǎn)者指明該柱可以反沖時(shí)，才可以反沖除去留在柱頭的雜質(zhì)否則反沖會(huì)迅速降低柱效
選擇使用適宜的流動(dòng)相（尤其是pH），以避免固定相被破壞有時(shí)可以在進(jìn)樣器前面連接一預(yù)柱，分析柱是鍵合硅膠時(shí)，預(yù)柱為硅膠，可使流動(dòng)相在進(jìn)入分析柱之前預(yù)先被硅膠"飽和"，避免分析柱中的硅膠基質(zhì)被溶解

經(jīng)常用強(qiáng)溶劑沖洗色譜柱，清除保留在柱內(nèi)的雜質(zhì)在進(jìn)行清洗時(shí)，對(duì)流路系統(tǒng)中流動(dòng)相的置換應(yīng)以相混溶的溶劑逐漸過(guò)渡，每種流動(dòng)相的體積應(yīng)是柱體積的20倍左右，即常規(guī)分析需要50~75ml
下面列舉一些的清洗溶劑及順序，作為參考：硅膠柱以正已烷（或庚烷）二氯甲烷和甲醇依次沖洗，然后再以相反順序依次沖洗，所有溶劑都必須嚴(yán)格脫水甲醇能洗去殘留的強(qiáng)極性雜質(zhì)，已烷使硅膠表面重新活化反相柱以水甲醇乙腈一氯甲烷（或氯仿）依次沖洗，再以相反順序依次沖洗如果下一步分析用的流動(dòng)相不含緩沖液，那么可以省略zui后用水沖洗這一步一氯甲烷能洗去殘留的非極性雜質(zhì)，在甲醇（乙腈）沖洗時(shí)重復(fù)注射100~200µl四氫呋喃數(shù)次有助于除去強(qiáng)疏水性雜質(zhì)四氫呋喃與乙腈或甲醇的混合溶液能除去類脂有時(shí)也注射二甲亞砜數(shù)次此外，用乙腈丙酮和三fu醋酸（0.1%）梯度洗脫能除去蛋白質(zhì)污染陽(yáng)離子交換柱可用稀酸緩沖液沖洗，陰離子交換柱可用稀堿緩沖液沖洗，除去交換性能強(qiáng)的鹽，然后用水甲醇二氯甲烷（除去吸附在固定相表面的有機(jī)物）甲醇水依次沖洗
保存時(shí)應(yīng)將柱內(nèi)充滿乙腈或甲醇，柱接頭要擰緊，防止溶劑揮發(fā)干燥禁止將緩沖溶液留在柱內(nèi)靜置過(guò)夜或更長(zhǎng)時(shí)間
色譜柱使用過(guò)程中，如果壓力升高，一種可能是燒結(jié)濾片被堵塞，這時(shí)應(yīng)更換濾片或?qū)⑵淙〕鲞M(jìn)行清洗；另一種可能是大分子進(jìn)入柱內(nèi)，使柱頭被污染；如果柱效降低或色譜峰變形，則可能柱頭出現(xiàn)塌陷，死體積增大在后兩種情況發(fā)生時(shí)，小心擰開(kāi)柱接頭，用潔凈小鋼將柱頭填料取出1~2mm高度（注意把被污染填料取凈）再把柱內(nèi)填料整平然后用適當(dāng)溶劑濕潤(rùn)的固定相（與柱內(nèi)相同）填滿，壓平，再擰緊柱接頭這樣處理后柱效能得到改善，但是很難恢復(fù)到新柱的水平柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前裝一根與分析柱相同固定相的短柱（5~30mm），可以起到保護(hù)延長(zhǎng)柱壽命的作用采用保護(hù)柱會(huì)損失一定的柱效，這是值得的 通常色譜柱壽命在正確使用時(shí)可達(dá)2年以上以硅膠為基質(zhì)的填料，只能在pH2~9范圍內(nèi)使用柱子使用一段時(shí)間后，可能有一些吸附作用強(qiáng)的物質(zhì)保留于柱頂，特別是一些有色物質(zhì)更易看清被吸著在柱頂?shù)奶盍仙闲碌?/font>在使用一段時(shí)間后柱頂填料可能塌陷，使柱效下降，這時(shí)也可補(bǔ)加填料使柱效恢復(fù)每次工作完后，用洗脫能力強(qiáng)的洗脫液沖洗，例如ODS柱宜用甲醇沖洗至基線平衡當(dāng)采用鹽緩沖溶液作流動(dòng)相時(shí)，使用完后應(yīng)用無(wú)鹽流動(dòng)相沖洗含鹵族元素（fu氯溴）的化合物可能會(huì)腐蝕不銹鋼管道，不宜長(zhǎng)期與之接觸裝在HPLC儀上柱子如不經(jīng)常使用，應(yīng)每隔4~5天開(kāi)機(jī)沖洗15分鐘

氮吹儀  固相萃取儀  抑菌圈測(cè)定儀        化學(xué)試劑  色譜柱  純水機(jī)        

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