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二代測序近年來飛速發(fā)展，做過文庫構(gòu)建的小主們，是不是曾經(jīng)深受文庫產(chǎn)量低、質(zhì)量差、測序數(shù)據(jù)不好這些問題的困擾？如何一步步排查問題，找到癥結(jié)并優(yōu)化呢？

別著急，小編在這里為大家整理了NGS文庫構(gòu)建中的連接模塊正確測評(píng)方法及連接效率的影響因素，看完以后大家就對接頭連接有全局的把握，排除連接模塊對文庫的影響更是不在話下！

說到接頭連接，就得從文庫制備的概念說起了……

文庫制備（Library Preparation）就是在DNA片段兩端連上特定序列的接頭（兩側(cè)的序列不同）的過程。

在連接接頭過程中，不是所有的DNA片段都能兩端接上接頭，接頭連接效率的概念在這里就要引入了。接頭連接效率是指在DNA片段兩端均加上測序接頭的DNA量占起始總DNA量的比值。它是影響文庫產(chǎn)量的重要指標(biāo)之一，對文庫的質(zhì)量和產(chǎn)量具有重要的影響。若連接效率低，那么未連上接頭的DNA片段無法得到PCR擴(kuò)增；連接效率越高，代表文庫轉(zhuǎn)化率越高，可以說，接頭連接效率直接影響終的文庫復(fù)雜度和有效測序數(shù)據(jù)。

接頭連接效率這么重要，要如何對連接效率進(jìn)行正確的測評(píng)呢？

1.一般連接效率的評(píng)測方法

方法一：對比連接前后文庫的量。

指的是測定接頭連接前的文庫量，然后進(jìn)行接頭連接，純化后測定剩余的文庫量。這類方法被很多人使用，實(shí)際上卻存在很大的問題。通常連接后文庫中，會(huì)存在接頭、未連接接頭片段或者單端連接接頭的文庫，通過Qubit熒光定量，只能確定總的雙鏈DNA量，無法確定有效的雙端連接接頭文庫的量。因此此方法會(huì)與實(shí)際結(jié)果存在巨大誤差。并且磁珠的純化也有一定的文庫損失，具體效率無法準(zhǔn)確把控。

方法二：更換連接模塊做平行測試。

指的是通過更換不同的連接模塊，對比終文庫產(chǎn)量，來評(píng)測不同連接模塊的連接效率高低。同樣，這類方法也存在一些弊端，首先這種方法無法排除不同連接模塊與原體系的兼容性對產(chǎn)量的影響，其次這種方法只能間接的反映哪種連接模塊更有優(yōu)勢，無法評(píng)測具體連接模塊的連接效率。

總結(jié)：

以上兩種接頭連接的測評(píng)方法其實(shí)都犯了一類錯(cuò)誤：將關(guān)注點(diǎn)放在文庫的產(chǎn)量上面而不是具體連接上接頭片段的比例。這是因?yàn)榻宇^的連接不僅要看接頭連接的文庫的產(chǎn)量，更要看連接文庫的效果，而后者才是評(píng)估連接效率的關(guān)鍵因素。

方法一：Agilent 2100檢測連接峰圖法

小編對此做了測試，對已知片段大小的DNA片段（350bp）進(jìn)行接頭連接，文庫在連接接頭后進(jìn)行Agilent 2100檢測，結(jié)果表明，雖然文庫連接上了接頭，但是只有兩端均連接上了接頭的文庫才能被擴(kuò)增和測序。當(dāng)未連接或單端連接接頭的含量很少時(shí)，或者雙端連接接頭的文庫含量高時(shí)，代表接頭連接的效率越高。

方法二：qPCR定量法

qPCR法定量文庫的方法是以qPCR為基礎(chǔ)，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的校準(zhǔn)，精確定量文庫中用于雙端完整接頭的文庫數(shù)量。因?yàn)榇朔椒ㄊ褂玫囊餅橥ㄓ眯蛄校糁挥幸欢诉B接接頭或未連接接頭的文庫是無法得到擴(kuò)增，也就是無法檢測到熒光值，終濃度是將這部分文庫排除。此方法可以精準(zhǔn)的測定文庫中成功連接接頭的文庫數(shù)量，以此可以精準(zhǔn)的評(píng)測連接的效率情況。

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