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安捷倫液相色譜儀測定小麥中內(nèi)源激素

植物激素對植物的種子萌發(fā)、生長、開花、成熟、衰老、休眠等生命活動起直接或間接的調(diào)節(jié)、控制作用。小麥是我國三大農(nóng)作物之一，如 何 調(diào) 控 其生長發(fā)育，進而促 進 分 蘗，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，備 受 農(nóng)業(yè)科研 人 員 的 關 注。了解小麥內(nèi)源激素的變化規(guī)律，對于研究其產(chǎn)量和抗性等具有重要的生產(chǎn)實踐價值。

本文研究對小麥中的ＩＡＡ、ＡＢＡ、ＧＡ３、ＺＴ、ＳＡ進 行 分 離 和 測 定，建立一種分析小 麥 激 素 的 有 效 方 法，從 而 為 小 麥 內(nèi)源激素調(diào)節(jié)和控 制 小 麥 的 生 長、衰老等研究提供關鍵技術。

１實驗部分

１．１儀器與試劑

Ａｇｉｌｅｎｔ１２００高 效 液 相 色 譜 儀，Ａｇｉｌｅｎｔ１２００系列泵，可變波長檢 測 器，ＴＵ１８１０紫外可見分光光度計，ＲＥ－５２Ａ旋轉(zhuǎn)蒸 發(fā) 儀，３２０－ＳｐＨ計，ＨＲ－１２０電 子 天 平，ＫＱ５００ＤＥ型 超 聲 波 脫 氣，ＢｅｃｋｍａｎＡｌｌｅｇｒａ６４Ｒ冷凍離心機。

玉米素、赤霉素、生長素、脫落酸、水楊酸標準品（純 度≥９９％），甲 醇、乙 酸（色 譜級），石 油 醚、乙 酸 乙 酯（分 析 純，國 藥 集團化學試劑有限公司），實驗用水為超純水。所有試劑在使用前均用０．４５μｍ微孔濾膜過濾。

１．    ２標準溶液的配制

用甲醇配制０．２ｇ／Ｌ生 長 素、０．１ｇ／Ｌ玉 米 素、０．１ｇ／Ｌ脫落酸、２．５ｇ／Ｌ赤霉素、０．４ｇ／Ｌ水楊酸的混合標準溶液。

１．    ３樣品前處理

稱取新鮮小麥葉２ｇ、根５ｇ，分別加入１０ｍＬ預冷的８０％（如無特殊說 明 均 為 體 積分 數(shù)）甲 醇，冰浴研磨成漿，保鮮 膜 密 封 后 于４°C冷 浸 過 夜。然 后于４°C條 件 下以８０００ｒ／ｍｉｎ離 心１０ｍｉｎ得 上 清液，殘渣加入８ｍＬ８０％的 冷 甲 醇 離 心１０ｍｉｎ后 合并上清液。全部濾 液 于４０°C下減壓濃縮至原體積的１／３，加 入３０ｍＬ石油 醚 萃 取 脫 色３次，棄 醚 相。水相用２０ｍＬ乙酸乙 酯 萃 取３次，合 并 酯 相，４０°C下減 壓 蒸 干。加 入ｐＨ３．５的 乙 酸 溶 液２ｍＬ，過Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８小柱純化，用甲醇洗脫，收集后在４０°C下減壓濃縮至干。用流動相溶解并定容至２ｍＬ，經(jīng)０．４５μｍ微孔濾膜過濾后進行ＨＰＬＣ分析。

１．    ４色譜條件色

譜 柱 為ＥｃｌｉｐｓｅＸＤＢ－Ｃ１８（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ，５μｍ，Ａｇｉｌｅｎｔ公 司），流 動 相Ａ為 甲 醇，Ｂ為乙 酸 的 水 溶 液（ｐＨ３．６），梯 度 條 件 為０～７ｍｉｎ２０％Ａ，７～１０ｍｉｎ２０％Ａ～２８％Ａ，１０～１７ｍｉｎ２８％Ａ，１７～１９ｍｉｎ２８％Ａ～４０％Ａ，１９～３５ｍｉｎ４０％Ａ。流 速 為１ｍＬ／ｍｉｎ，進 樣 量 為１０μＬ。檢測 器 波 長 設 置 為２５４ｎｍ；１４．５ｍｉｎ時 切 換 到２４０ｎｍ；ＳＡ洗脫 后 即１８ｍｉｎ時 切 換 回２５４ｎｍ。檢測溫度為室溫。

２結(jié)果與討論

２．    １樣品處理條件的優(yōu)化

由于水楊酸含量低且易被ＰＶＰＰ吸附，選擇Ｓｅｐ－ＰａｋＣ１８小 柱 純 化。對５種激素提取效果良好。

２．２色譜條件的選擇

２．２．１流動相梯度

綜 合 考 慮 各 激素分離度、峰形的對稱性以及縮短分析時間，zui終采用１．４節(jié)所述的梯度洗脫條件。

２．２．２流動相的ｐＨ

選 擇ｐＨ３．６的 乙酸的水溶液為 流 動 相Ｂ，各峰的分離度以及保留時間都較好。

2．２．３檢測波長

選 擇 在ＳＡ出 峰 前（１４．５ｍｉｎ）將檢測器波長 切 換 到２４０ｎｍ，待 出 峰 *結(jié)束后（１８ｍｉｎ）切回２５４ｎｍ（圖１ｂ）。切 換 波 長 更 利于 待 測 組 分 的 分析 檢 測。

２．２．４流速

流 速 為１ｍＬ／ｍｉｎ時，各激素能在３５ｍｉｎ內(nèi)很好的分離。在優(yōu)化的色 譜 條 件下，對混合的標準樣品進行檢測。５種 激 素 能 夠 較 好 地 分離和檢出。

2.３標準曲線及其線性范圍

以５種激素的標準溶液為原液進行逐級稀釋，在優(yōu) 化 的 色 譜 條 件 下 分 析。以峰面積為縱坐標（ｙ），質(zhì)量濃度 為 橫 坐 標（ｘ，ｍｇ／Ｌ），計 算 各 內(nèi) 源 激素的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍，同時按３倍信噪比得到 各 激 素 檢 出 限（見 表１）。由 結(jié) 果 可 知，標準品濃度與峰面積的相關性良好。

2.   ４回收率的測定和實際樣品分析

取小麥根樣品２ｇ，按照１．３節(jié)方法制備樣品并用上述條件進行 測 定。如 圖３所 示，小麥 根 中 的 激素能得到很好 的 分 離。隨 后 進 行 加 標 回 收 試 驗，結(jié)果見表２。

３結(jié)論

通過優(yōu)化小麥中５種內(nèi)源激素的提取條件以及色譜條件，建立了一種簡單、有效的液相色譜分析方法。分離效果理想，加 標 回 收 率 達９６％～９８％，檢出限為０．１９５～０．９７６ｍｇ／Ｌ。方法滿足激素 定 量分析的測定要求，為進一步檢測小麥生長過程中內(nèi)源激素的變化、激素代謝與小麥的生長、衰老等相關性研究提供了關鍵技術。