非食用著色劑酸性橙Ⅱ，Acid Orange 7，染料索引號：C.I. 15510，是一種常用的工業(yè)染料，有強致癌性。因其色澤鮮艷、勻染性好、價格低廉等特點，酸性橙Ⅱ常被不法商家偷偷使用于食品生產(chǎn)加工，因而酸性橙Ⅱ被列入食品中禁用著色劑的檢測范圍。目前，國家已經(jīng)發(fā)布3個推薦性的食品中酸性橙Ⅱ檢測標(biāo)準(zhǔn)，但由于不同實驗室間儀器、人員、實驗耗材、樣品等條件存在差異，*執(zhí)行方法就能達(dá)到回收率、精密度要求的情況很少。因此，根據(jù)實際情況進(jìn)行方法的優(yōu)化是必要的。
 

　　近，小編在用不同的基質(zhì)按照標(biāo)準(zhǔn)《SN/T 3536-2013 出口食品中酸性橙Ⅱ號的檢測方法》做酸性橙Ⅱ回收實驗時，發(fā)現(xiàn)回收率不很理想，而且6.1.2所規(guī)定的固態(tài)樣品前處理方法非常耗時(特別是凈化前提取液需“濃縮約至10mL”這一步)。因此小編依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法對不同實驗環(huán)節(jié)進(jìn)行了一些優(yōu)化，在這里將全過程分享給各位朋友以供參考交流~
 

　　樣品凈化步驟
 

　　樣品凈化步驟優(yōu)化涉及SPE小柱與濾膜的選擇、固相萃取操作步驟。
 

　　首先，我們需要按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行實驗，驗證所用SPE小柱與濾膜是否滿足當(dāng)下實驗條件需求：
 

　　1. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)3.6節(jié)(見下圖)選擇對應(yīng)的SPE小柱。
 

　　由此，小編選擇了月旭Welchrom® NH2小柱(500mg/6ml,30pk，貨號：00509-11006)。
 

　　2. 使用酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液，按標(biāo)準(zhǔn)6.1.3節(jié)的凈化方法(見下圖)進(jìn)行固相萃取操作(小柱的活化方法見3.6)，留取每一操作步驟的樣液用于上機檢測。
 

　　在這里，小編移取0.1mL 10mg/L酸性橙Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)溶液，加10mL水混勻作為上樣溶液,并根據(jù)6.1.3分別收集上樣液、淋洗液、洗脫液、二次洗脫液進(jìn)行上機檢測(此方法又稱“分步留樣”，是分析SPE操作過程中影響回收率的環(huán)節(jié)及原因的常用方法)。
 

　　3. 選擇合適的濾膜過濾樣液，上機檢測。
 

　　根據(jù)6.1.3，樣液上機前要過膜凈化。我們都知道，濾膜作用是凈化樣液，防止雜質(zhì)污染色譜柱。但使用濾膜(或使用不合適的濾膜)可能會影響目標(biāo)物的回收率甚至引入雜峰。因此，小編嘗試了三種過膜方式：1) 不過膜；2) 水系濾膜；3) Nylon濾膜。
 

藍(lán)色為樣液不過膜，峰面積12.0191
 

　　粉色為樣液過水系濾膜，峰面積11.4695
 

　　黑色為樣液過Nylon濾膜，峰面積6.4975
 

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)過膜后，過膜樣液的圖譜峰面積：過Nylon濾膜<過水系濾膜<不過膜，說明過水系膜或有機系膜都對目標(biāo)物造成一定損失。因此后續(xù)實驗的樣液均不過膜上機。建議本實驗樣液上機前不過膜。
 

　　后，小編發(fā)現(xiàn)上樣液、淋洗液以及兩次的洗脫液中都沒有目標(biāo)物酸性橙Ⅱ檢出，酸性橙Ⅱ終的回收率已經(jīng)達(dá)到了95%-105%，滿足了檢測的要求。
 

　　樣品提取步驟優(yōu)化
 

　　其次，按照標(biāo)準(zhǔn)方法小編進(jìn)行了空白基質(zhì)加標(biāo)實驗，驗證樣品提取步驟是否影響不同基質(zhì)樣品中目標(biāo)物的回收。實驗方法如下圖所示。、
 

實驗過程中，小編發(fā)現(xiàn)：
 

　　6.1.2固態(tài)試樣提取方法中提及：要用20mL乙醇-氨溶液(配制方法見3.4)提取2遍，再合并提取液，濃縮至10mL。
 

　　此時洗脫液總量約40mL，需40℃濃縮至10mL左右【相當(dāng)于除去乙醇】。整個濃縮過程非常耗時，差不多處理一個樣要一小時，而且終的結(jié)果回收率非常不理想。
 

　　按照第yi次實驗的結(jié)果，小編進(jìn)行了一些優(yōu)化，標(biāo)準(zhǔn)上是全部提取液濃縮至10mL左右后凈化，改為移取了其中20mL經(jīng)濃縮至約5mL后上樣。
 

　　根據(jù)第二次實驗結(jié)果，回收率已經(jīng)達(dá)到了90%-100%，滿足了檢測的要求。
 

　　終優(yōu)化后的實驗步驟和譜圖
 

一、提取
 

　　稱取樣品2g(±0.01g)于50mL離心管中，加入20mL乙醇-氨溶液，超聲提取30min，離心10min(4000r/min)，吸取上清液于另一50mL離心管中；殘渣中加入20mL乙醇-氨溶液，重復(fù)提取一次，合并兩次上清液，混勻，準(zhǔn)確移取20mL上清液，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至少于5mL,轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，用水定容至10mL，待凈化。
 

　　二、凈化
 

　　SPE柱：月旭Welchrom® NH2規(guī)格：500 mg/6mL
 

　　活化：依次用5mL甲醇，5mL2%甲酸水溶液過柱，棄去流出液
 

　　上樣：將待凈化液全部上樣，自然流干，棄去流出液
 

　　淋洗：依次用5mL2%甲酸水溶液，再用5mL甲醇淋洗小柱，棄去流出液
 

　　洗脫：用5mL10%氨水甲醇溶液，收集于15mL試管中，抽干小柱
 

　　濃縮：氮吹至近干，用水定容至1mL,上HPLC檢測。
 

　　三、儀器條件
 

　　色譜柱：月旭Ultimate®XB-C18,4.6×250mm,5μm
 

　　流動相：乙酸銨：甲醇=35:65
 

　　柱溫：35℃
 

　　進(jìn)樣量：20μL
 

　　檢測波長：484nm
 

　　流速：1.0mL/min
 

總結(jié)
 

　　在優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)方法的時候：
 

　　1）先選擇合適的SPE小柱，用目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行固相萃取操作，分步排查SPE步驟，確認(rèn)小柱與標(biāo)準(zhǔn)方法是否滿足具體要求；
 

　　2）再按標(biāo)準(zhǔn)方法，做空白基質(zhì)加標(biāo)，確認(rèn)前處理樣品提取步驟中目標(biāo)物的損失情況，分析造成目標(biāo)物損失的原因及步驟，有針對性優(yōu)化方法；
 

　　3）接著做樣品和樣加標(biāo)，看目標(biāo)物回收率情況，優(yōu)化提取量或提取次數(shù)；后得出一個穩(wěn)定的方法，保證滿足標(biāo)準(zhǔn)回收率要求進(jìn)行檢測。